Хвороба Альцгеймера (БА) не має білкових біомаркерів, які відображають її численні патофізіологічні властивості, що перешкоджає прогресу діагностики та лікування. Тут ми використовуємо комплексну протеоміку для ідентифікації біомаркерів цереброспінальної рідини (ЦСР), які представляють широкий спектр патофізіології AD. Мультиплексна мас-спектрометрія ідентифікувала приблизно 3 500 і приблизно 12 000 білків у СМР і головному мозку відповідно. Мережевий аналіз протеома мозку дозволив 44 модулі біорізноманіття, 15 з яких перекривалися протеомом спинномозкової рідини. Маркери AD CSF у цих модулях, що перекриваються, складаються в п’ять білкових груп, що представляють різні патофізіологічні процеси. Синапси та метаболіти в головному мозку AD зменшуються, але CSF збільшується, тоді як багата гліями мієлінізація та імунні групи в мозку та CSF збільшуються. Постійність і специфічність панелі змін були підтверджені в більш ніж 500 додаткових зразках СМР. Ці групи також визначили біологічні підгрупи при безсимптомному AD. Загалом, ці результати є багатообіцяючим кроком до веб-інструментів біомаркерів для клінічного застосування при AD.
Хвороба Альцгеймера (ХА) є найпоширенішою причиною нейродегенеративної деменції в усьому світі і характеризується широким спектром дисфункцій біологічних систем, включаючи синаптичну передачу, опосередкований глією імунітет і мітохондріальний метаболізм (1-3). Однак його встановлені білкові біомаркери все ще зосереджені на виявленні амілоїду та тау-білка, і тому не можуть відображати цю різноманітну патофізіологію. Ці «основні» білкові біомаркери, які найбільш надійно вимірюються в цереброспінальній рідині (СМР), включають (i) бета-амілоїдний пептид 1-42 (Aβ1-42), який відображає утворення кортикальних амілоїдних бляшок; (ii) загальний тау, ознака дегенерації аксона; (iii) фосфо-тау (p-тау), представник патологічного гіперфосфорилювання тау (4-7). Хоча ці біомаркери спинномозкової рідини значно полегшили наше виявлення «виражених» білкових захворювань AD (4-7), вони представляють лише невелику частину складної біології, що стоїть за хворобою.
Відсутність патофізіологічного різноманіття біомаркерів AD призвела до багатьох проблем, включаючи (i) нездатність ідентифікувати та кількісно визначити біологічну неоднорідність пацієнтів з AD, (ii) недостатнє вимірювання тяжкості та прогресування захворювання, особливо на доклінічній стадії, і (ii) iii) розробка терапевтичних препаратів, які не змогли повністю вирішити всі аспекти неврологічного погіршення. Наша опора на визначну патологію для опису AD від пов’язаних захворювань лише посилює ці проблеми. Все більше доказів показує, що більшість людей похилого віку з деменцією мають більше ніж одну патологічну характеристику зниження когнітивних функцій (8). Приблизно 90% або більше осіб з патологією AD також мають судинні захворювання, включення TDP-43 або інші дегенеративні захворювання (9). Ці високі частки патологічного перекриття порушили нашу поточну діагностичну базу для деменції, і потрібне більш повне патофізіологічне визначення захворювання.
Зважаючи на нагальну потребу в різноманітних біомаркерах AD, у цій галузі все частіше застосовують метод «omics», заснований на загальній системі виявлення біомаркерів. Альянс Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD був започаткований у 2014 році та є лідером програми. Ці міждисциплінарні зусилля Національних інститутів охорони здоров’я, наукових кіл та промисловості спрямовані на використання системних стратегій для кращого визначення патофізіології AD та розробки діагностичного аналізу біорізноманіття та стратегій лікування (10). У рамках цього проекту мережева протеоміка стала багатообіцяючим інструментом для вдосконалення системних біомаркерів у AD. Цей неупереджений підхід, керований даними, організовує складні протеомні набори даних у групи або «модулі» коекспресованих білків, які пов’язані з конкретними типами клітин, органелами та біологічними функціями (11-13). Майже 12 насичених інформацією мережевих протеомних досліджень були проведені на мозку AD (13-23). Загалом, ці аналізи вказують на те, що протеом мозкової мережі AD підтримує висококонсервативну модульну організацію в незалежних когортах і кількох кортикальних областях. Крім того, деякі з цих модулів показують відтворювані зміни в кількості, пов’язаній з AD, у наборах даних, що відображає патофізіологію багатьох захворювань. У сукупності ці висновки демонструють багатообіцяючу опорну точку для відкриття протеома мозкової мережі як системного біомаркера при AD.
Щоб перетворити протеом мозкової мережі AD у клінічно корисні системні біомаркери, ми об’єднали отриману з мозку мережу з протеомним аналізом CSF AD. Цей інтегрований підхід призвів до ідентифікації п’яти багатообіцяючих наборів біомаркерів спинномозкової рідини, які пов’язані з широким спектром патофізіології головного мозку, включаючи синапси, кровоносні судини, мієлінізацію, запалення та дисфункцію метаболічних шляхів. Ми успішно перевірили ці панелі біомаркерів за допомогою багаторазового реплікаційного аналізу, включаючи понад 500 зразків СМР від різних нейродегенеративних захворювань. Ці валідаційні аналізи включають дослідження групових мішеней у спинномозковій рідині пацієнтів з безсимптомним AD (AsymAD) або показ ознак аномального накопичення амілоїду в нормальному когнітивному середовищі. Ці аналізи підкреслюють значну біологічну неоднорідність у популяції AsymAD і ідентифікують панелі маркерів, за якими можна визначити субтип осіб на найраніших стадіях захворювання. Загалом, ці результати є ключовим кроком у розробці інструментів білкових біомаркерів на основі багатьох систем, які можуть успішно вирішити багато клінічних проблем, з якими стикається AD.
Основною метою цього дослідження є ідентифікація нових біомаркерів цереброспінальної рідини, які відображають різні патофізіологічні особливості мозку, що призводять до AD. На малюнку S1 представлено нашу методологію дослідження, яка включає (i) всебічний аналіз на основі попередніх результатів АД СМЖ і мережевого протеома головного мозку для ідентифікації багатьох біомаркерів захворювань СМЖ, пов’язаних із мозком, і (ii) подальшу реплікацію. Ці біомаркери знаходяться в кількох незалежних цереброспинальних рідинні когорти. Дослідження, орієнтоване на відкриття, почалося з аналізу диференціальної експресії СМР у 20 когнітивно нормальних осіб і 20 пацієнтів з AD у Центрі дослідження хвороби Альцгеймера (ADRC) імені Еморі Гоїзуети. Діагноз AD визначається як значне когнітивне порушення за наявності низького рівня Aβ1-42 і підвищених рівнів загального тау- та p-tau у спинномозковій рідині [Середня оцінка когнітивних функцій за Монреалем (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Таблиця S1A). Контроль (середній MoCA, 26,7 ± 2,2) мав нормальний рівень біомаркерів CSF.
СМР людини характеризується динамічним діапазоном великої кількості білка, в якому альбумін та інші надзвичайно поширені білки можуть перешкоджати виявленню цікавих білків (24). Щоб збільшити глибину виявлення білків, ми видалили перші 14 білків у великій кількості з кожного зразка СМР перед аналізом мас-спектрометрії (МС) (24). Загалом за допомогою MS було ідентифіковано 39 805 пептидів, які були зіставлені з 3691 протеомом у 40 зразках. Кількісне визначення білка виконується за допомогою множинного тандемного маркування масою (TMT) (18, 25). Щоб усунути відсутні дані, ми включили лише ті білки, які були кількісно визначені принаймні в 50% зразків у подальшому аналізі, таким чином остаточно визначивши кількісно 2875 протеомів. Через значну різницю в рівнях загальної кількості білка контрольний зразок статистично вважався викидом (13) і не був включений у подальший аналіз. Значення чисельності решти 39 зразків були скориговані відповідно до віку, статі та коваріації партії (13-15, 17, 18, 20, 26).
Використовуючи статистичний t-критерій аналізу для оцінки диференціальної експресії на наборі даних регресії, цей аналіз визначив білки, рівні чисельності яких були значно змінені (P <0,05) між контрольною та AD випадками (таблиця S2A). Як показано на малюнку 1A, кількість загалом 225 білків у AD була значно зменшена, а кількість 303 білків значно зросла. Ці диференціально експресовані білки включають декілька раніше ідентифікованих маркерів AD цереброспінальної рідини, таких як білок тау, пов’язаний з мікротрубочками (MAPT; P = 3,52 × 10-8), нейрофіламент (NEFL; P = 6,56 × 10-3), пов’язаний з ростом білок 43 (GAP43; P = 1,46 × 10–5), білок, що зв’язує жирні кислоти 3 (FABP3; P = 2,00 × 10–5), хітиназа 3, як 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10–6), нейронний гранулін (NRGN; P = 3,43 × 10-4) і фактор росту нервів VGF (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Однак ми також визначили інші дуже важливі цілі, такі як інгібітор дисоціації GDP 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) і зв’язане з SPARC модульне зв’язування кальцію 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9) . Аналіз генної онтології (GO) 225 значно знижених білків виявив тісний зв’язок із процесами рідини організму, такими як метаболізм стероїдів, згортання крові та гормональна активність (рис. 1B і таблиця S2B). Навпаки, значне збільшення білка 303 тісно пов’язане зі структурою клітини та енергетичним обміном.
(A) Графік вулкана показує зміну кратності log2 (вісь х) відносно статистичного значення P -log10 (вісь y), отриманого за допомогою t-критерію, який використовується для виявлення диференційної експресії між контролем (CT) і AD випадки CSF протеома всіх білків. Білки зі значно зниженими рівнями (P <0,05) при AD показані синім кольором, тоді як білки зі значно підвищеними рівнями при хворобі показані червоним. Вибраний білок маркується. (B) Верхні терміни GO, пов’язані з білком, значно знижені (синій) і підвищені (червоний) при AD. Показує три терміни GO з найвищими z-балами в областях біологічних процесів, молекулярних функцій і клітинних компонентів. (C) Виміряний МС рівень MAPT у зразку СМР (ліворуч) і його кореляція з рівнем тау зразка ELISA (праворуч). Відображається коефіцієнт кореляції Пірсона з відповідним значенням P. Через відсутність даних ELISA для одного випадку AD ці цифри включають значення для 38 із 39 проаналізованих випадків. (D) Контрольований кластерний аналіз (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) скоригований P <0,01) на контролі та AD CSF виявив зразки з використанням 65 найбільш істотно змінених білків у наборі даних. Стандартизувати, нормалізувати.
Протеомний рівень MAPT тісно пов’язаний з незалежно виміряним рівнем тау ELISA (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; рис. 1C), що підтверджує достовірність нашого вимірювання MS. Після розщеплення трипсином на рівні білка-попередника амілоїду (АРР) специфічні ізоформи пептиди, нанесені на C-кінець Aβ1-40 і Aβ1-42, не можуть бути ефективно іонізовані (27, 28). Таким чином, пептиди АРР, які ми ідентифікували, не мають нічого спільного з рівнями Aβ1-42 ELISA. Щоб оцінити диференціальну експресію в кожному випадку, ми використовували диференційовано експресовані білки з P <0,0001 [частота помилкових відкриттів (FDR) скоригована P <0,01] для виконання контрольованого кластерного аналізу зразків (таблиця S2A). Як показано на малюнку 1D, ці 65 високозначущих білків можуть правильно групувати зразки відповідно до стану захворювання, за винятком одного випадку AD з контрольними характеристиками. З цих 65 білків 63 зросли при AD, тоді як лише два (CD74 і ISLR) знизилися. Загалом ці аналізи спинномозкової рідини виявили сотні білків у AD, які можуть служити біомаркерами захворювання.
Потім ми провели незалежний мережевий аналіз протеома мозку AD. Мозкова когорта цього відкриття включала дорсолатеральну префронтальну кору (DLPFC) із контрольних випадків (n = 10), хворобу Паркінсона (PD; n = 10), змішану AD/PD (n = 10) і AD (n = 10). ) Зразок. Емері Гойзуета ADRC. Демографічні дані цих 40 випадків були описані раніше (25) і підсумовані в таблиці S1B. Ми використали TMT-MS для аналізу цих 40 тканин мозку та когорти реплікації з 27 випадків. Загалом ці два набори даних мозку дали 227 121 унікальних пептидів, які були зіставлені з 12 943 протеомами (25). Тільки ті білки, які були кількісно визначені принаймні в 50% випадків, були включені в подальші дослідження. Остаточний набір даних відкриття містить 8817 кількісно визначених білків. Відрегулюйте рівень надлишку білка залежно від віку, статі та посмертного інтервалу (PMI). Диференціальний аналіз експресії набору даних після регресії показав, що >2000 рівнів білка були значно змінені [P <0,05, дисперсійний аналіз (ANOVA)] у двох або більше когортах захворювання. Потім ми провели контрольований кластерний аналіз на основі диференціально експресованих білків і P <0,0001 у порівняннях AD/контроль та/або AD/PD (рис. S2, A і B, таблиця S2C). Ці 165 сильно змінених білків чітко відображають випадки патології AD з контрольних зразків і зразків PD, підтверджуючи сильні специфічні для AD зміни у всьому протеомі.
Потім ми використали алгоритм під назвою Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) для виконання мережевого аналізу виявленого протеому мозку, який організовує набір даних у білкові модулі з подібними моделями експресії (11-13). Аналіз виявив 44 модулі (M) коекспресованих білків, відсортованих і пронумерованих від найбільшого (M1, n = 1821 білка) до найменшого (M44, n = 34 білка) (Малюнок 2A і Таблиця S2D) . Як зазначалося вище (13) Обчисліть репрезентативний профіль експресії або характерний білок кожного модуля та співвіднесіть його зі станом захворювання та патологією AD, тобто встановіть альянс Реєстру хвороб Альцгеймера (CERAD) та шкали Бреака (Малюнок 2B). Загалом 17 модулів були суттєво пов’язані з нейропатологією AD (P <0,05). Багато з цих пов’язаних із захворюваннями модулів також багаті маркерами, специфічними для типу клітин (рис. 2B). Як згадувалося вище (13), збагачення типу клітини визначається шляхом аналізу перекривання модулів і списку посилань генів, специфічних для типу клітини. Ці гени отримані з опублікованих даних ізольованих мишачих нейронів, ендотеліальних і гліальних клітин. Експеримент секвенування РНК (RNA-seq) (29).
(A) Відкрийте WGCNA протеома мозку. (B) Аналіз двовагової середньої кореляції (BiCor) модульного сигнатурного білка (першого основного компонента експресії модульного білка) з невропатологічними характеристиками AD (вгорі), включаючи показники CERAD (Aβ-бляшки) і Braak (тау-клубки). Інтенсивність позитивної (червоний) і негативної (синій) кореляцій показана двокольоровою теплою картою, а зірочки вказують на статистичну значущість (P <0,05). Використовуйте гіпергеометричний точний тест Фішера (FET) (внизу), щоб оцінити асоціацію типу клітини кожного білкового модуля. Інтенсивність червоного затінення вказує на ступінь збагачення типу клітин, а зірочка вказує на статистичну значущість (P <0,05). Використовуйте метод BH, щоб виправити значення P, отримане від польового транзистора. (C) GO аналіз модульних білків. Найбільш тісно пов'язані біологічні процеси показані для кожного модуля або пов'язаної групи модулів. оліго, олігодендроцит.
Набір із п’яти тісно пов’язаних модулів, багатих на астроцити та мікроглію (M30, M29, M18, M24 та M5), продемонстрував сильну позитивну кореляцію з нейропатологією AD (рис. 2B). Онтологічний аналіз пов’язує ці гліальні модулі з ростом, проліферацією та імунітетом клітин (рис. 2C і таблиця S2E). Два додаткові гліальні модулі, M8 і M22, також сильно підвищуються при захворюванні. M8 дуже пов’язаний з Toll-подібним рецепторним шляхом, сигнальним каскадом, який відіграє ключову роль у вродженій імунній відповіді (30). У той же час M22 тісно пов'язаний з посттрансляційною модифікацією. M2, який багатий олігодендроцитами, демонструє сильну позитивну кореляцію з патологією AD та онтологічний зв’язок із синтезом нуклеозидів і реплікацією ДНК, що вказує на посилену проліферацію клітин при захворюваннях. Загалом, ці висновки підтверджують підвищення гліальних модулів, яке ми раніше спостерігали в протеомі мережі AD (13, 17). Наразі виявлено, що багато гліальних модулів, пов’язаних з AD, у мережі демонструють нижчі рівні експресії в контрольних випадках і випадках PD, підкреслюючи їх специфічність захворювання, яка є підвищеною при AD (рис. S2C).
Лише чотири модулі в нашому мережевому протеомі (M1, M3, M10 і M32) сильно негативно корелюють з патологією AD (P <0,05) (рис. 2, B і C). І M1, і M3 багаті на нейронні маркери. M1 тісно пов'язаний із синаптичними сигналами, тоді як M3 тісно пов'язаний з мітохондріальною функцією. Немає доказів збагачення типів клітин для M10 і M32. M32 відображає зв'язок між M3 і клітинним метаболізмом, тоді як M10 сильно пов'язаний з ростом клітин і функцією мікротрубочок. Порівняно з AD, усі чотири модулі посилені в контролі та PD, надаючи їм специфічні для захворювання зміни AD (рис. S2C). Загалом, ці результати підтверджують зменшення кількості модулів, багатих на нейрони, які ми раніше спостерігали в AD (13, 17). Підводячи підсумок, мережевий аналіз протеома мозку, який ми виявили, створив модулі, спеціально змінені AD, що відповідає нашим попереднім висновкам.
AD характеризується ранньою безсимптомною стадією (AsymAD), на якій у людей спостерігається накопичення амілоїду без клінічного зниження когнітивних функцій (5, 31). Ця безсимптомна стадія є критичним вікном для раннього виявлення та втручання. Раніше ми продемонстрували сильне модульне збереження протеома мозкової мережі AsymAD і AD у незалежних наборах даних (13, 17). Щоб переконатися, що мозкова мережа, яку ми зараз виявили, узгоджується з цими попередніми висновками, ми проаналізували збереження 44 модулів у відтвореному наборі даних від 27 організацій DLPFC. Ці організації включають контроль (n = 10), випадки AsymAD (n = 8) і AD (n = 9). Контрольні зразки та зразки AD були включені в аналіз нашої когорти мозку відкриття (таблиця S1B), тоді як випадки AsymAD були унікальними лише в когорті реплікації. Ці випадки AsymAD також надійшли з банку мозку Emory Goizueta ADRC. Хоча когнітивні функції були нормальними на момент смерті, рівні амілоїду були аномально високими (середній CERAD, 2,8 ± 0,5) (таблиця S1B).
Аналіз цих 27 тканин головного мозку TMT-MS дав результат кількісного визначення 11 244 протеомів. Цей остаточний підрахунок включає лише ті білки, які кількісно визначені принаймні в 50% зразків. Цей відтворений набір даних містить 8638 (98,0%) з 8817 білків, виявлених у нашому дослідницькому аналізі мозку, і містить майже 3000 значно змінених білків між контрольною та AD когортами (P <0,05, після парного t-тесту Тьюкі для дисперсійного аналізу) ( Таблиця S2F). Серед цих диференційовано експресованих білків 910 також показав значні зміни рівня між AD та контрольними випадками протеома мозку (P <0,05, після парного t-тесту ANOVA Tukey). Варто зазначити, що ці 910 маркерів дуже узгоджені в напрямку зміни між протеомами (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (рис. S3A). Серед збільшених білків білки з найбільш узгодженими змінами між наборами даних в основному є членами багатих на глію модулів M5 і M18 (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 і GFAP). Серед зменшених білків, ті з найбільш послідовними змінами були майже виключно членами модуля M1 (NPTX2, VGF і RPH3A), пов’язаного із синапсом. Ми далі перевірили пов’язані з AD зміни мідкіну (MDK), CD44, секретованого пов’язаного з frizzled білка 1 (SFRP1) і VGF за допомогою вестерн-блоттингу (рис. S3B). Аналіз збереження модулів показав, що близько 80% білкових модулів (34/44) у протеомі головного мозку були значно збережені в наборі даних реплікації (z-показник> 1,96, скоригований FDR P <0,05) (рис. S3C). Чотирнадцять із цих модулів були спеціально зарезервовані між двома протеомами (z-оцінка> 10, скоригований FDR P <1,0 × 10-23). Загалом, виявлення та реплікація високого ступеня узгодженості в диференціальній експресії та модульній композиції між протеомами мозку підкреслює відтворюваність змін у білках лобової кори AD. Крім того, було підтверджено, що AsymAD і більш запущені захворювання мають дуже схожу структуру мережі мозку.
Більш детальний аналіз диференціальної експресії в наборі даних реплікації мозку підкреслює значний ступінь змін білка AsymAD, включаючи загалом 151 білок зі значною зміною між AsymAD і контролем (P <0,05) (Рисунок S3D). Відповідно до амілоїдного навантаження, АРР у мозку AsymAD та AD значно збільшився. MAPT суттєво змінюється лише при AD, що узгоджується з підвищеним рівнем клубків і його відомим зв’язком із зниженням когнітивних функцій (5, 7). Збагачені гліями модулі (M5 і M18) значною мірою відображаються на підвищених білках в AsymAD, тоді як пов’язаний з нейронами модуль M1 є найбільш репрезентативним зі знижених білків в AsymAD. Багато з цих маркерів AsymAD показують більші зміни в симптоматичних захворюваннях. Серед цих маркерів є SMOC1, гліальний білок, що належить до M18, який пов’язаний з пухлинами мозку та розвитком очей і кінцівок (32). MDK є гепарин-зв'язуючим фактором росту, пов'язаним з ростом клітин і ангіогенезом (33), іншим членом M18. Порівняно з контрольною групою, AsymAD значно підвищився, а потім більше підвищився AD. Навпаки, синаптичний білок нейропентраксин 2 (NPTX2) був значно знижений у мозку AsymAD. NPTX2 раніше асоціювався з нейродегенерацією та відіграє визнану роль у опосередкуванні збуджувальних синапсів (34). Загалом, ці результати виявляють різноманітні доклінічні зміни білка при AD, які, здається, прогресують із тяжкістю захворювання.
Враховуючи те, що ми досягли значної глибини охоплення білком у відкритті протеома мозку, ми намагаємося більш повно зрозуміти його перекриття з транскриптомом AD на рівні мережі. Тому ми порівняли протеом мозку, який ми виявили, з модулем, який ми раніше згенерували з вимірювання мікроматриці 18 204 генів у AD (n = 308) і контрольних (n = 157) тканинах DLPFC (13). перекриття. Загалом ми ідентифікували 20 різних модулів РНК, багато з яких продемонстрували збагачення конкретних типів клітин, включаючи нейрони, олігодендроцити, астроцити та мікроглію (рис. 3A). Численні зміни цих модулів в AD показано на малюнку 3B. Згідно з нашим попереднім аналізом перекривання білок-РНК з використанням глибшого неміченого протеома MS (близько 3000 білків) (13), більшість із 44 модулів у мережі протеомів мозку, які ми виявили, знаходяться в мережі транскриптомів. Значного перекриття немає. Навіть у наше відкриття та реплікація 34 білкових модулів, які сильно зберігаються в протеомі мозку, лише 14 (~40%) пройшли точний тест Фішера (FET) показали статистично значуще перекриття з транскриптомом (рис. 3A). Сумісний із відновленням пошкоджень ДНК (P-M25 і P-M19), трансляцією білків (P-M7 і P-M20), зв'язуванням/сплайсингом РНК (P-M16 і P-M21) і націлюванням на білки (P-M13 і P- M23) не перекривається з модулями в транскриптомі. Таким чином, хоча в поточному аналізі перекриття (13) використовується більш глибокий набір даних про протеоми, більшість протеомів мережі AD не відображаються в мережі транскриптомів.
(A) Гіпергеометричний FET демонструє збагачення специфічних для клітинного типу маркерів у РНК-модулі транскриптома AD (вгорі) та ступінь перекриття між РНК (вісь x) і білковими (вісь y) модулями мозку AD (внизу) . Інтенсивність червоного затінення вказує на ступінь збагачення типів клітин у верхній панелі та інтенсивність перекриття модулів у нижній панелі. Зірочки вказують на статистичну значущість (P <0,05). (B) Ступінь кореляції між характерними генами кожного транскриптомного модуля та статусом AD. Модулі ліворуч найбільш негативно корелюють з AD (синій), а ті, що праворуч, найбільш позитивно корелюють з AD (червоний). Значення P, скориговане за логарифмічним перетворенням BH, вказує на ступінь статистичної значущості кожної кореляції. (C) Значні модулі, що перекриваються, із збагаченням спільного типу комірки. (D) Кореляційний аналіз log2-кратної зміни міченого білка (вісь x) і РНК (вісь y) у модулі, що перекривається. Відображається коефіцієнт кореляції Пірсона з відповідним значенням P. Мікро, мікроглія; небесні тіла, астроцити. КТ, контроль.
Більшість білкових і РНК-модулів, що перекриваються, мають подібні профілі збагачення типу клітин і послідовні напрямки зміни AD (рис. 3, B і C). Іншими словами, пов’язаний із синапсом модуль M1 протеома головного мозку (PM1) відображається на трьох гомологічних РНК-модулях, насичених нейронами (R-M1, R-M9 і R-M16), які знаходяться в AD. Обидва показали знижений рівень. Подібним чином модулі білка M5 і M18, багаті гліями, перекриваються модулями РНК, багатими астроцитами та мікрогліальними маркерами (R-M3, R-M7 і R-M10), і беруть активну участь у розвитку захворювань. Ці спільні модульні функції між двома наборами даних додатково підтримують збагачення типів клітин і пов’язані із захворюваннями зміни, які ми спостерігали в протеомі мозку. Однак ми спостерігали багато суттєвих відмінностей між рівнями РНК і білків окремих маркерів у цих спільних модулях. Кореляційний аналіз диференціального вираження протеоміки та транскриптоміки молекул у цих модулях, що перекриваються (рис. 3D), підкреслює цю невідповідність. Наприклад, АРР і кілька інших білків гліального модуля (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 і SFRP1) продемонстрували значне збільшення протеома AD, але майже не було змін у транскриптомі AD. Ці білково-специфічні зміни можуть бути тісно пов’язані з амілоїдними бляшками (23, 35), висвітлюючи протеом як джерело патологічних змін, і ці зміни можуть не відображатися в транскриптомі.
Після незалежного аналізу протеомів головного мозку та ліквору, які ми виявили, ми провели комплексний аналіз двох наборів даних, щоб ідентифікувати біомаркери AD CSF, пов’язані з патофізіологією мозкової мережі. Спочатку ми повинні визначити перекривання двох протеомів. Хоча загальновизнано, що спинномозкова рідина відображає нейрохімічні зміни в мозку AD (4), точний ступінь перекриття між мозком AD і протеомом спинномозкової рідини неясний. Порівнюючи кількість спільних генних продуктів, виявлених у наших двох протеомах, ми виявили, що майже 70% (n = 1936) білків, виявлених у спинномозковій рідині, також були кількісно визначені в мозку (рис. 4A). Більшість цих білків, що перекриваються (n = 1721), відображаються в одному з 44 модулів спільної експресії з набору даних про мозок відкриття (Рис. 4B). Як і очікувалося, шість найбільших модулів мозку (від M1 до M6) показали найбільше перекриття спинномозкової рідини. Однак існують менші мозкові модулі (наприклад, M15 і M29), які досягають неочікувано високого ступеня перекриття, більшого, ніж мозковий модуль, який удвічі перевищує розмір. Це спонукає нас прийняти більш детальний, статистично керований метод розрахунку перекриття між мозком і спинномозковою рідиною.
(A і B) Протеїни, виявлені в досліджуваному мозку та наборах даних CSF, збігаються. Більшість цих білків, що перекриваються, пов’язані з одним із 44 модулів коекспресії мережі коекспресії мозку. (C) Відкрийте перекриття між протеомом спинномозкової рідини та протеомом мозкової мережі. Кожен рядок теплової карти представляє окремий аналіз перекриття гіпергеометричного польового транзистора. Верхній рядок зображує перекриття (сіре/чорне затінення) між мозковим модулем і всім протеомом CSF. Другий рядок показує, що перекриття між модулями головного мозку та білком СМР (заштрихованим червоним) значно посилюється при AD (P <0,05). Третій ряд показує, що перекриття між модулями головного мозку та білком CSF (синє затінення) значно знижується при AD (P <0,05). Використовуйте метод BH, щоб виправити значення P, отримане від польового транзистора. (D) Складна модульна панель на основі асоціації типу комірок і відповідних термінів GO. Ці панелі містять загалом 271 білок, пов’язаний з мозком, які мають значущу диференціальну експресію в протеомі CSF.
Використовуючи односторонні польові транзистори, ми оцінили важливість перекривання білка між протеомом CSF та окремими модулями мозку. Аналіз виявив, що загалом 14 модулів мозку в наборі даних СМР мають статистично значущі перекриття (скоригований FDR P <0,05), а також додатковий модуль (M18), перекриття якого є близьким до значущого (скоригований FDR P = 0,06) (рис. 4C). , верхній ряд). Нас також цікавлять модулі, які сильно перекриваються з диференціально експресованими білками CSF. Таким чином, ми застосували два додаткові аналізи FET, щоб визначити, який із (i) білка спинномозкової рідини був значно збільшений при AD та (ii) білок CSF був значно знижений при AD (P <0,05, парний t-тест AD/контроль) Мозкові модулі зі значущим перекриттям між ними. Як показано в середньому та нижньому рядках рисунка 4C, ці додаткові аналізи показують, що 8 із 44 модулів мозку суттєво збігаються з білком, доданим у CSF AD (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 та M38). . ), у той час як лише два модулі (M6 і M15) показали значуще перекриття зі зниженим білком у AD CSF. Як і очікувалося, усі 10 модулів знаходяться в 15 модулях з найбільшим перекриттям з протеомом CSF. Таким чином, ми припускаємо, що ці 15 модулів є високопродуктивними джерелами біомаркерів спинномозкової рідини мозку, отриманих від AD.
Ми склали ці 15 модулів, що перекриваються, у п’ять великих білкових панелей на основі їх близькості на діаграмі дерева WGCNA та їх зв’язку з типами клітин і онтологією генів (рис. 4D). Перша панель містить модулі, багаті маркерами нейронів і пов’язаними з синапсами білками (M1 і M12). Синаптична панель містить загалом 94 білки, і рівні в протеомі спинномозкової рідини значно змінилися, що зробило її найбільшим джерелом пов’язаних із мозком маркерів спинномозкової рідини серед п’яти панелей. Друга група (М6 і М15) продемонструвала тісний зв'язок з маркерами ендотеліальних клітин і судинним тілом, такими як «загоєння ран» (М6) і «регуляція гуморальної імунної відповіді» (М15). M15 також сильно пов’язаний з метаболізмом ліпопротеїдів, який тісно пов’язаний з ендотелієм (36). Судинна панель містить 34 маркери СМР, пов’язані з мозком. До третьої групи входять модулі (М2 і М4), які суттєво пов’язані з маркерами олігодендроцитів і проліферацією клітин. Наприклад, терміни онтології верхнього рівня M2 включають «позитивну регуляцію реплікації ДНК» і «процес пуринового біосинтезу». Тим часом M4 включає «диференціювання гліальних клітин» і «сегрегацію хромосом». Панель мієлінізації містить 49 маркерів СМР, пов’язаних із мозком.
Четверта група містить найбільше модулів (M30, M29, M18, M24 і M5), і майже всі модулі значно багаті маркерами мікроглії та астроцитів. Подібно до панелі мієлінізації, четверта панель також містить модулі (M30, M29 і M18), які тісно пов’язані з проліферацією клітин. Інші модулі в цій групі тісно пов’язані з імунологічними термінами, такими як «процес імунної дії» (M5) і «регуляція імунної відповіді» (M24). Гліальна імунна група містить 42 CSF маркери, пов’язані з мозком. Нарешті, остання панель містить 52 маркери, пов’язані з мозком, на чотирьох модулях (M44, M3, M33 і M38), усі з яких на тілі пов’язані зі збереженням енергії та метаболізмом. Найбільший із цих модулів (M3) тісно пов’язаний з мітохондріями та багатий нейроноспецифічними маркерами. M38 є одним із менших членів модуля в цьому метаболомі, а також демонструє помірну специфічність нейронів.
Загалом, ці п’ять панелей відображають широкий діапазон типів клітин і функцій у корі головного мозку AD і разом містять 271 пов’язаний із мозком CSF маркер (таблиця S2G). Щоб оцінити достовірність цих результатів МС, ми використали метод розширення близькості (PEA), технологію на основі ортогональних антитіл із можливостями мультиплексування, високою чутливістю та специфічністю, і повторно проаналізували зразки спинномозкової рідини, які ми знайшли. Підгрупа цих 271 біомаркерів (n = 36). Ці 36 мішеней демонструють зміну множника AD для PEA, яка тісно пов’язана з нашими результатами на основі MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), що підтверджує результати нашого комплексного аналізу MS (рис. S4). ).
Біологічні теми, на яких наголошують наші п’ять груп, від синаптичної сигналізації до енергетичного метаболізму, усі пов’язані з патогенезом AD (1-3). Отже, усі 15 модулів, що містять ці панелі, пов’язані з патологією AD у протеомі головного мозку, яку ми виявили (рис. 2B). Найбільш помітним є висока позитивна патологічна кореляція між нашими гліальними модулями та сильна негативна патологічна кореляція між нашими найбільшими нейронними модулями (M1 і M3). Аналіз диференціальної експресії нашого реплікованого протеома мозку (рис. S3D) також висвітлює гліальні білки M5 і M18. При AsymAD і симптоматичному AD найбільше збільшується кількість гліальних білків і M1-пов’язаних синапсів. Білок знижується найбільше. Ці спостереження вказують на те, що 271 маркер цереброспінальної рідини, який ми визначили в п’яти групах, пов’язані з хворобливими процесами в корі AD, включаючи ті, що відбуваються на ранніх безсимптомних стадіях.
Щоб краще проаналізувати напрямок зміни панелі білків у мозку та спинномозковій рідині, ми намалювали наступне для кожного з 15 модулів, що перекриваються: (i) знайшли рівень надлишку модуля в наборі даних мозку та (ii) модуль білок Різниця виражається в цереброспінальній рідині (рис. S5). Як згадувалося раніше, WGCNA використовується для визначення кількості модуля або характерного значення білка в мозку (13). Карта вулкана використовується для опису диференціальної експресії модульних білків у спинномозковій рідині (AD/контроль). Ці цифри показують, що три з п’яти панелей демонструють різні тенденції експресії в мозку та спинномозковій рідині. Два модулі панелі синапсів (M1 і M12) показують зниження рівня надлишку в головному мозку AD, але значно збігаються зі збільшенням білка в CSF AD (рис. S5A). Пов’язані з нейронами модулі, що містять метаболом (M3 і M38), продемонстрували подібні непослідовні моделі експресії мозку та спинномозкової рідини (рис. S5E). Судинна панель також показала різні тенденції експресії, хоча її модулі (M6 і M15) були помірно збільшені в головному мозку AD і знижені в ураженій CSF (рис. S5B). Дві панелі, що залишилися, містять великі гліальні мережі, протеїни яких постійно підвищуються в обох компартментах (рис. S5, C і D).
Зауважте, що ці тенденції не є спільними для всіх маркерів на цих панелях. Наприклад, синаптична панель включає кілька білків, кількість яких значно знижена в головному мозку AD і CSF (рис. S5A). Серед цих маркерів цереброспінальної рідини зі зниженою регуляцією є NPTX2 і VGF M1 і хромогранін B M12. Однак, незважаючи на ці винятки, більшість наших синаптичних маркерів підвищені в спинномозковій рідині AD. Загалом, ці аналізи дозволили розрізнити статистично значущі тенденції в рівнях головного мозку та спинномозкової рідини в кожній із наших п’яти панелей. Ці тенденції підкреслюють складний і часто різний зв’язок між експресією білка мозку та СМР при AD.
Потім ми використали високопродуктивний аналіз реплікації MS (реплікація CSF 1), щоб звузити наш набір із 271 біомаркера до найбільш перспективних і відтворюваних цілей (рис. 5A). Копія 1 спинномозкової рідини містить загалом 96 зразків з Emory Goizueta ADRC, включаючи контроль, AsymAD та когорту AD (таблиця S1A). Ці випадки AD характеризуються легким зниженням когнітивних функцій (середній MoCA, 20,0 ± 3,8) і змінами біомаркерів AD, підтвердженими в спинномозковій рідині (таблиця S1A). На відміну від виявленого нами аналізу спинномозкової рідини, ця реплікація виконується з використанням більш ефективного та високопродуктивного «одноразового» методу МС (без автономного фракціонування), включаючи спрощений протокол підготовки зразків, який усуває потребу в зниженні імунітету окремих зразків. . Замість цього для посилення сигналу менш поширених білків використовується єдиний «канал посилення», виснажений імунною системою (37). Незважаючи на те, що він зменшує загальне покриття протеомів, цей одноразовий метод значно скорочує машинний час і збільшує кількість мічених TMT зразків, які можна проаналізувати як життєздатні (17, 38). Загалом аналіз ідентифікував 6487 пептидів, які зіставлялися з 1183 протеомами у 96 випадках. Як і в аналізі СМР, який ми виявили, лише ті білки, кількісно визначені принаймні в 50% зразків, були включені в подальші розрахунки, а дані були регресовані для впливу віку та статі. Це призвело до остаточної кількісної оцінки 792 протеомів, 95% з яких також були ідентифіковані у знайденому наборі даних CSF.
(A) Білкові мішені CSF, пов’язані з мозком, перевірені в першій реплікованій когорті CSF і включені в остаточну панель (n = 60). (B–E) Рівні панельних біомаркерів (зведені z-показники), виміряні в чотирьох когортах реплікації CSF. Для оцінки статистичної значущості змін чисельності в кожному повторному аналізі використовували парні t-тести або дисперсійний аналіз з посткорекцією Тьюкі. КТ, контроль.
Оскільки ми особливо зацікавлені у перевірці наших 271 мішеней, пов’язаних із мозковою спинномозковою рідиною, шляхом всебічного аналізу, ми обмежимо подальше дослідження цього реплікованого протеому цими маркерами. Серед цих 271 білків 100 були виявлені в реплікації CSF 1. На малюнку S6A показано диференційовану експресію цих 100 маркерів, що перекриваються між контрольними зразками та зразками реплікації AD. Синаптичні та метаболітні гістони найбільше збільшуються при AD, тоді як судинні білки найбільше знижуються при захворюванні. Більшість із 100 маркерів, що перекриваються (n = 70), зберігали однаковий напрямок змін у двох наборах даних (рис. S6B). Ці 70 валідованих пов’язаних із мозком CSF маркерів (таблиця S2H) значною мірою відображають раніше спостережувані тенденції експресії панелі, тобто зниження регуляції судинних білків і посилення всіх інших панелей. Лише 10 із цих 70 валідованих білків показали зміни в кількості AD, які суперечили цим панельним тенденціям. Для того, щоб створити панель, яка найкраще відображає загальну тенденцію мозку та спинномозкової рідини, ми виключили ці 10 білків із панелі інтересів, яку ми остаточно перевірили (Малюнок 5A). Таким чином, наша панель зрештою включає загалом 60 білків, перевірених у двох незалежних когортах CSF AD з використанням різних методів підготовки зразків та аналізу платформи MS. Графіки експресії z-показника цих остаточних панелей у контрольній копії 1 СМР та у випадках AD підтвердили панельну тенденцію, що спостерігається в когорті СМР, яку ми знайшли (Малюнок 5B).
Серед цих 60 білків є молекули, які, як відомо, пов’язані з AD, такі як остеопонтин (SPP1), який є прозапальним цитокіном, який асоціюється з AD у багатьох дослідженнях (39-41), і GAP43, синаптичний білок це явно пов’язано з нейродегенерацією (42). Найбільш повно перевірені білки є маркерами, пов’язаними з іншими нейродегенеративними захворюваннями, такими як супероксиддисмутаза 1 (SOD1), пов’язана з бічним аміотрофічним склерозом (БАС), і десахараза, пов’язана з хворобою Паркінсона (PARK7). Ми також підтвердили, що багато інших маркерів, таких як SMOC1 і сигнальний білок 1 прикріплення до мембрани мозку (BASP1), обмежують попередні зв’язки з нейродегенерацією. Варто зазначити, що через їх низьку загальну кількість у протеомі СМР нам важко використовувати цей високопродуктивний одноразовий метод виявлення для надійного виявлення MAPT та деяких інших білків, пов’язаних з AD (наприклад, NEFL та NRGN). ) ( 43, 44).
Потім ми перевірили ці 60 маркерів пріоритетних панелей у трьох додаткових повторних аналізах. У CSF Copy 2 ми використовували одну TMT-MS для аналізу незалежної когорти з 297 контрольних зразків і зразків AD від Emory Goizueta ADRC (17). Реплікація ліквору 3 включала повторний аналіз доступних даних ТМТ-МС від 120 контрольних пацієнтів і пацієнтів з AD з Лозанни, Швейцарія (45). Ми виявили понад дві третини з 60 маркерів пріоритету в кожному наборі даних. Незважаючи на те, що швейцарське дослідження використовувало різні платформи MS і методи кількісної оцінки TMT (45, 46), ми чітко відтворили наші панельні тенденції в двох повторних аналізах (рис. 5, C і D, а також таблиці S2, I і J). Щоб оцінити специфічність захворювання в нашій групі, ми використовували TMT-MS для аналізу четвертого набору даних реплікації (реплікація СМР 4), який включав не лише контроль (n = 18) і AD (n = 17) випадки, але й PD ( n = 14)), ALS (n = 18) і зразки лобно-скроневої деменції (FTD) (n = 11) (Таблиця S1A). Ми успішно кількісно оцінили майже дві третини панельних білків у цій когорті (38 із 60). Ці результати підкреслюють специфічні для AD зміни на всіх п’яти панелях біомаркерів (рис. 5E і таблиця S2K). Збільшення в групі метаболітів продемонструвало найсильнішу специфічність AD, за якою слідували мієлінізація та гліальна група. Меншою мірою FTD також показує збільшення між цими панелями, що може відображати подібні потенційні зміни мережі (17). Навпаки, ALS і PD показали майже такі самі мієлінізації, гліальні та метаболомні профілі, як і контрольна група. Загалом, незважаючи на відмінності в підготовці зразків, платформі MS і методах кількісного визначення ТМТ, ці повторювані аналізи показують, що наші маркери пріоритетної панелі мають дуже узгоджені специфічні зміни AD у понад 500 унікальних зразках СМР.
Нейродегенерація AD була широко визнана за кілька років до появи когнітивних симптомів, тому існує нагальна потреба в біомаркерах AsymAD (5, 31). Проте все більше доказів показує, що біологія AsymAD далеко не однорідна, а складна взаємодія ризику та стійкості призводить до великих індивідуальних відмінностей у подальшому прогресуванні захворювання (47). Незважаючи на те, що використовуються для ідентифікації випадків AsymAD, рівні основних біомаркерів СМР (Aβ1-42, загальний тау і р-тау) не можуть надійно передбачити, хто прогресуватиме до деменції (4, 7), що свідчить про те, що це може бути необхідно включити цілісні інструменти біомаркерів, засновані на багатьох аспектах фізіології мозку, щоб точно стратифікувати ризик цієї популяції. Тому згодом ми проаналізували нашу перевірену AD панель біомаркерів у популяції AsymAD CSF копії 1. Ці 31 випадок AsymAD показали аномальні рівні основних біомаркерів (співвідношення Aβ1–42/загальний тау ELISA, <5,5) і повну когнітивну функцію (середній MoCA, 27,1). ± 2,2) (Таблиця S1A). Крім того, усі люди з AsymAD мають клінічну деменцію 0 балів, що вказує на те, що немає доказів зниження щоденної когнітивної або функціональної продуктивності.
Спочатку ми проаналізували рівні валідованих панелей у всіх 96 повторах CSF 1, включаючи когорту AsymAD. Ми виявили, що кілька панелей у групі AsymAD мали значні зміни кількості, подібні до AD, судинна панель показала тенденцію до зниження в AsymAD, тоді як усі інші панелі показали тенденцію до зростання (рис. 6A). Таким чином, усі панелі продемонстрували дуже значущу кореляцію з ELISA Aβ1-42 і загальним рівнем тау (рис. 6B). Навпаки, кореляція між групою та оцінкою MoCA є відносно поганою. Одним із найбільш вражаючих висновків цих аналізів є великий діапазон кількості панелей у когорті AsymAD. Як показано на малюнку 6A, рівень панелі групи AsymAD зазвичай перетинає рівень панелі контрольної групи та групи AD, демонструючи відносно високу варіабельність. Для подальшого вивчення цієї неоднорідності AsymAD ми застосували аналіз багатовимірного шкалювання (MDS) до 96 випадків реплікації 1 СМР. Аналіз MDS дозволяє візуалізувати подібність між випадками на основі певних змінних у наборі даних. Для цього кластерного аналізу ми використовуємо лише перевірені панельні маркери, які мають статистично значущу зміну (P <0,05, AD/контроль) на рівні виявлення та реплікації 1 протеома CSF (n = 29) (Таблиця S2L). Цей аналіз дав чітку просторову кластеризацію між нашим контролем і випадками AD (рис. 6C). Навпаки, деякі випадки AsymAD чітко згруповані в контрольній групі, тоді як інші розташовані у випадках AD. Для подальшого вивчення цієї неоднорідності AsymAD ми використали нашу карту MDS, щоб визначити дві групи цих випадків AsymAD. Перша група включала випадки AsymAD, згруповані ближче до контролю (n = 19), тоді як друга група характеризувалася випадками AsymAD з маркерним профілем, ближчим до AD (n = 12).
(A) Рівень експресії (z-показник) групи біомаркерів CSF у всіх 96 зразках у когорті реплікації CSF 1, включаючи AsymAD. Аналіз дисперсії з посткорекцією Тьюкі використовувався для оцінки статистичної значущості змін чисельності панелей. (B) Кореляційний аналіз рівня надлишку білка панелі (z-показник) з оцінкою MoCA та загальним рівнем тау в ELISA Aβ1-42 і зразках CSF копії 1. Відображається коефіцієнт кореляції Пірсона з відповідним значенням P. (C) MDS 96 випадків CSF копії 1 ґрунтувався на рівнях чисельності 29 валідованих панельних маркерів, які були значно змінені як у наборах даних відкриття, так і в CSF копії 1 [P <0,05 AD/контроль (CT)]. Цей аналіз був використаний для поділу групи AsymAD на контрольну (n = 19) і AD (n = 12) підгрупи. (D) Діаграма вулкана показує диференціальну експресію всіх білків реплікації CSF 1 зі зміною кратності log2 (вісь х) відносно статистичного значення P -log10 між двома підгрупами AsymAD. Панель біомаркерів кольорова. (E) Рівень реплікації CSF 1 біомаркерів селекційної групи по-різному експресується між підгрупами AsymAD. Для оцінки статистичної значущості використовувався дисперсійний аналіз за Тьюкі.
Ми досліджували диференціальну експресію білка між цими контрольними та AD-подібними випадками AsymAD (рис. 6D і таблиця S2L). Отримана карта вулканів показує, що 14 маркерів панелей суттєво змінилися між двома групами. Більшість цих маркерів є членами синапсу та метаболома. Однак SOD1 і субстрат білої кінази С, збагачений мірістоїльованим аланіном (MARCKS), які належать до мієлінової та гліальної імунних груп відповідно, також належать до цієї групи (рис. 6, D і E). Судинна панель також внесла два маркери, які були значно знижені в AD-подібній групі AsymAD, включаючи AE зв’язуючий білок 1 (AEBP1) і член родини комплементу C9. Не було значної різниці між контрольною та AD-подібною підгрупами AsymAD в ELISA AB1-42 (P = 0,38) і p-tau (P = 0,28), але дійсно була значна різниця в загальному рівні тау (P = 0,0031). ) (Рис. S7). Є кілька маркерів на панелі, які вказують на те, що зміни між двома підгрупами AsymAD більш значні, ніж загальні рівні тау (наприклад, YWHAZ, SOD1 і MDH1) (Малюнок 6E). Загалом ці результати вказують на те, що наша перевірена панель може містити біомаркери, які можуть підтипувати та потенційно ризикувати пацієнтів із безсимптомним захворюванням.
Існує нагальна потреба в системних інструментах біомаркерів для кращого вимірювання та націлювання на різноманітну патофізіологію, що стоїть за AD. Очікується, що ці інструменти не тільки змінять нашу діагностичну базу AD, але й сприятимуть прийняттю ефективних стратегій лікування, орієнтованих на кожного пацієнта (1, 2). З цією метою ми застосували неупереджений комплексний підхід протеоміки до головного мозку та спинномозкової рідини, щоб ідентифікувати веб-біомаркерів спинномозкової рідини, які відображають широкий спектр патофізіології мозку. Наш аналіз створив п’ять панелей біомаркерів CSF, які (i) відображають синапси, кровоносні судини, мієлін, імунну та метаболічну дисфункцію; (ii) продемонструвати високу відтворюваність на різних платформах MS; (iii) Показати прогресуючі зміни, характерні для захворювання, на ранніх і пізніх стадіях AD. Загалом, ці висновки є багатообіцяючим кроком до розробки різноманітних, надійних, веб-орієнтованих інструментів біомаркерів для досліджень AD та клінічних застосувань.
Наші результати демонструють висококонсервативну організацію протеома мозкової мережі AD і підтримують його використання як якір для системного розвитку біомаркерів. Наш аналіз показує, що два незалежні набори даних TMT-MS, що містять мозок AD і AsymAD, мають сильну модульність. Ці знахідки доповнюють нашу попередню роботу, демонструючи збереження потужних модулів понад 2000 тканин мозку з багатьох незалежних когорт у лобовій, тім’яній та скроневій корі (17). Ця консенсусна мережа відображає різноманітні зміни, пов’язані із захворюванням, які спостерігаються в поточних дослідженнях, включаючи збільшення запальних модулів, багатих гліями, і зменшення модулів, багатих нейронами. Подібно до поточних досліджень, ця широкомасштабна мережа також має значні модульні зміни в AsymAD, демонструючи різноманітність різноманітної доклінічної патофізіології (17).
Однак у рамках цієї висококонсервативної системної системи існує більш тонка біологічна гетерогенність, особливо серед осіб на ранніх стадіях AD. Наша панель біомаркерів здатна зобразити дві підгрупи в AsymAD, які демонструють значну диференціальну експресію багатьох маркерів СМР. Наша група змогла підкреслити біологічні відмінності між цими двома підгрупами, які не були очевидними на рівні основних біомаркерів AD. Порівняно з контрольною групою співвідношення Aβ1-42/загальний тау у цих осіб AsymAD було аномально низьким. Однак лише загальні рівні тау істотно відрізнялися між двома підгрупами AsymAD, тоді як рівні Aβ1-42 і р-тау залишалися відносно порівнянними. Оскільки високий тау ліквору є кращим предиктором когнітивних симптомів, ніж рівень Aβ1-42 (7), ми підозрюємо, що дві когорти AsymAD можуть мати різні ризики прогресування захворювання. Враховуючи обмежений розмір вибірки нашого AsymAD і відсутність лонгітюдних даних, необхідні подальші дослідження, щоб впевнено зробити ці висновки. Однак ці результати вказують на те, що системна панель СМР може покращити нашу здатність ефективно стратифікувати людей під час безсимптомної стадії захворювання.
Загалом, наші висновки підтверджують роль багатьох біологічних функцій у патогенезі AD. Однак нерегульований енергетичний метаболізм став головною темою всіх наших п’яти підтверджених панелей маркування. Метаболічні білки, такі як гіпоксантин-гуанінфосфорибозилтрансфераза 1 (HPRT1) і лактатдегідрогеназа A (LDHA), є найбільш надійно підтвердженими синаптичними біомаркерами, що вказує на те, що підвищення AD CSF є високовідтворюваною статтю. Наші кровоносні судини та гліальні панелі також містять декілька маркерів, які беруть участь у метаболізмі окисних речовин. Ці висновки узгоджуються з ключовою роллю, яку метаболічні процеси відіграють у всьому мозку не тільки для задоволення високого енергетичного попиту нейронів, але й для задоволення високого енергетичного попиту астроцитів та інших гліальних клітин (17, 48). Наші результати підтверджують все більше доказів того, що зміни в окисно-відновному потенціалі та переривання енергетичних шляхів можуть бути основним зв’язком між декількома ключовими процесами, залученими до патогенезу AD, включаючи мітохондріальні розлади, опосередковане гліями запалення та пошкодження судин (49). Крім того, метаболічні біомаркери спинномозкової рідини містять велику кількість диференціально багатих білків між нашою контрольною та AD-подібною підгрупами AsymAD, що свідчить про те, що порушення цих енергетичних та окисно-відновних шляхів може бути критичним на доклінічній стадії захворювання.
Різні тенденції панелей мозку та спинномозкової рідини, які ми спостерігали, також мають цікаві біологічні наслідки. Синапси та метаболоми, багаті нейронами, демонструють зниження рівня в головному мозку AD та збільшення кількості в спинномозковій рідині. З огляду на те, що нейрони багаті мітохондріями, що виробляють енергію в синапсах, щоб забезпечити енергію для своїх численних спеціалізованих сигналів (50), очікується подібність профілів експресії цих двох груп нейронів. Втрата нейронів і екструзія пошкоджених клітин можуть пояснити ці тенденції панелі мозку та СМР у пізнішому захворюванні, але вони не можуть пояснити ранні зміни панелі, які ми спостерігаємо (13). Одним із можливих пояснень цих знахідок на ранній стадії безсимптомного захворювання є аномальне синаптичне обрізання. Нові дані на мишачих моделях свідчать про те, що опосередкований мікроглією синаптичний фагоцитоз може аномально активуватися при AD і призводити до ранньої втрати синапсів у мозку (51). Цей викинутий синаптичний матеріал може накопичуватися в спинномозковій рідині, тому ми спостерігаємо збільшення ЦСР на панелі нейронів. Імуноопосередковане синаптичне обрізання також може частково пояснити збільшення гліальних білків, які ми спостерігаємо в мозку та спинномозковій рідині протягом усього процесу захворювання. На додаток до синаптичного обрізання, загальні аномалії в екзоцитозному шляху також можуть призводити до різних експресій нейрональних маркерів у мозку та лікворі. Низка досліджень показала, що вміст екзосом у патогенезі AD мозку змінився (52). Позаклітинний шлях також бере участь у проліферації Aβ (53, 54). Варто зазначити, що пригнічення екзосомальної секреції може зменшити AD-подібну патологію в трансгенних мишачих моделях AD (55).
У той же час білок у судинній панелі показав помірне збільшення в AD мозку, але значно знизився в CSF. Дисфункція гематоенцефалічного бар'єру (ГЕБ) може частково пояснити ці висновки. Багато незалежних посмертних досліджень на людях продемонстрували розпад ГЕБ при AD (56, 57). Ці дослідження підтвердили різноманітні аномальні дії, що оточують цей щільно закритий шар ендотеліальних клітин, включаючи витік капілярів головного мозку та периваскулярне накопичення білків, що переносяться кров’ю (57). Це може дати просте пояснення підвищеного вмісту судинних білків у мозку, але воно не може повністю пояснити виснаження цих самих білків у спинномозковій рідині. Однією з можливостей є те, що центральна нервова система активно ізолює ці молекули, щоб вирішити проблему підвищеного запалення та окисного стресу. Зменшення деяких із найважчих білків СМР у цій панелі, особливо тих, які беруть участь у регуляції ліпопротеїдів, пов’язане з пригніченням шкідливих рівнів запалення та нейропротекторного процесу активних форм кисню. Це вірно для пароксонази 1 (PON1), ферменту, що зв’язує ліпопротеїни, відповідального за зниження рівня окислювального стресу в кровообігу (58, 59). Попередник альфа-1-мікроглобуліну/бікуніну (AMBP) є ще одним значно зниженим маркером судинної групи. Це попередник транспортера ліпідів бікуніну, який також бере участь у придушенні запалення та неврологічному захисті (60, 61).
Незважаючи на різні цікаві гіпотези, нездатність безпосередньо виявити біохімічні механізми захворювання є добре відомим обмеженням аналізу протеоміки, заснованого на відкриттях. Тому необхідні подальші дослідження, щоб впевнено визначити механізми, що стоять за цими панелями біомаркерів. Щоб рухатися до розвитку клінічного аналізу на основі MS, майбутній напрямок також вимагає використання цільових кількісних методів для широкомасштабної верифікації біомаркерів, таких як селективний або паралельний моніторинг реакції (62). Нещодавно ми використовували паралельний моніторинг реакції (63), щоб підтвердити багато описаних тут змін у білку CSF. Кількісно визначено кілька пріоритетних панелей із значною точністю, включаючи YWHAZ, ALDOA та SMOC1, які відображаються на наших панелях синапсів, метаболізму та запалення відповідно (63). Незалежний збір даних (DIA) та інші стратегії на базі MS також можуть бути корисними для цільової перевірки. Bud та ін. (64) Нещодавно було продемонстровано, що існує значне збігання між біомаркерами AD, визначеними в нашому наборі даних виявлення СМР, і незалежному наборі даних DIA-MS, який складається з майже 200 зразків СМР із трьох різних європейських когорт. Ці нещодавні дослідження підтверджують потенціал наших панелей для перетворення на надійне виявлення на основі MS. Традиційне виявлення на основі антитіл і аптамерів також важливо для подальшого розвитку ключових біомаркерів AD. Через низьку кількість СМР важче виявити ці біомаркери за допомогою високопродуктивних методів МС. NEFL і NRGN є двома такими прикладами низьких біомаркерів CSF, які відображаються на панелі в нашому всебічному аналізі, але не можуть бути надійно виявлені за допомогою нашої єдиної стратегії MS. Стратегії націлювання на основі кількох антитіл, таких як PEA, можуть сприяти клінічній трансформації цих маркерів.
Загалом це дослідження забезпечує унікальний протеомічний підхід для ідентифікації та верифікації біомаркерів AD СМР на основі різних систем. Оптимізація цих панелей маркерів для додаткових когорт AD і платформ MS може виявитися перспективною для покращення стратифікації ризиків AD та лікування. Дослідження, які оцінюють лонгітюдний рівень цих панелей у часі, також мають вирішальне значення для визначення того, яка комбінація маркерів найкраще стратифікує ризик раннього захворювання та зміни тяжкості захворювання.
За винятком 3 зразків, скопійованих CSF, усі зразки CSF, використані в цьому дослідженні, були зібрані під егідою Emory ADRC або тісно пов’язаних дослідницьких установ. Загалом у цих дослідженнях протеоміки було використано чотири набори зразків спинномозкової рідини Еморі. Було виявлено, що когорта CSF містить зразки 20 здорових контрольних осіб і 20 пацієнтів з AD. Копія CSF 1 включає зразки від 32 здорових осіб контролю, 31 особи з AsymAD та 33 особи з AD. Копія CSF 2 містить 147 контролів і 150 зразків AD. Когорта реплікації СМР 4 із різними захворюваннями включала 18 контрольних, 17 AD, 19 ALS, 13 PD та 11 зразків FTD. Відповідно до угоди, схваленої Інституційною ревізійною радою університету Еморі, усі учасники дослідження Еморі отримали інформовану згоду. Відповідно до рекомендацій Національного інституту старіння за 2014 рік для центрів хвороби Альцгеймера (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), спинномозкову рідину збирали та зберігали за допомогою люмбальної пункції. Пацієнти контрольної групи та AsymAD та AD отримували стандартизовану когнітивну оцінку в клініці когнітивної неврології Emory або Goizueta ADRC. Їхні зразки спинномозкової рідини були протестовані INNO-BIA AlzBio3 Luminex на ELISA Aβ1-42, загальний тау та p-tau аналіз (65). Значення ELISA використовуються для підтримки діагностичної класифікації суб’єктів на основі встановлених критеріїв відсікання біомаркерів AD (66, 67). Основні демографічні та діагностичні дані для інших діагнозів CSF (FTD, ALS та PD) також отримані від Emory ADRC або афілійованих дослідницьких установ. Зведені метадані випадків для цих випадків СМР Еморі можна знайти в таблиці S1A. Характеристики швейцарської когорти реплікації CSF 3 були опубліковані раніше (45).
СМР знайшов зразок. Щоб збільшити глибину нашого відкриття набору даних СМР, перед трипсинізацією було виконано імунне споживання білків з високим вмістом. Коротше кажучи, 130 мкл CSF з 40 окремих зразків CSF і рівний об’єм (130 мкл) смоли High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) поміщали в спінову колонку (Thermo Fisher Scientific, A89868) при кімнатній кімнаті. температура Інкубуйте). Після віджиму протягом 15 хвилин центрифугуйте зразок при 1000 g протягом 2 хвилин. Ультрацентрифужний фільтрувальний пристрій 3K (Millipore, UFC500396) використовували для концентрування зразка стоків центрифугуванням при 14000g протягом 30 хвилин. Розведіть усі об’єми зразків до 75 мкл фосфатно-сольовим буфером. Концентрацію білка оцінювали методом біцинхонінової кислоти (BCA) згідно з протоколом виробника (Thermo Fisher Scientific). CSF з виснаженим імунітетом (60 мкл) з усіх 40 зразків розщеплювали лізилендопептидазою (LysC) і трипсином. Коротше кажучи, зразок відновили та алкілували 1,2 мкл 0,5 М трис-2(-карбоксиетил)-фосфіну та 3 мкл 0,8 М хлорацетаміду при 90°C протягом 10 хвилин, а потім обробляли ультразвуком на водяній бані протягом 15 хвилин. Зразок розбавляли 193 мкл 8 М сечовини буфера [8 М сечовини та 100 мМ NaHPO4 (рН 8,5)] до кінцевої концентрації 6 М сечовини. LysC (4,5 мкг; Wako) використовується для розщеплення протягом ночі при кімнатній температурі. Потім зразок розбавляли до 1 М сечовини 50 мМ бікарбонатом амонію (ABC) (68). Додайте рівну кількість (4,5 мкг) трипсину (Promega), а потім інкубуйте зразок протягом 12 годин. Підкисліть розщеплений пептидний розчин до кінцевої концентрації 1% мурашиної кислоти (FA) і 0,1% трифтороцтової кислоти (TFA) (66), а потім знесоліть за допомогою 50 мг колонки Sep-Pak C18 (Waters), як описано вище (25). . Пептид потім элюировали в 1 мл 50% ацетонітрилу (ACN). Щоб стандартизувати кількісне визначення білка в партіях (25), 100 мкл аліквоти з усіх 40 зразків ліквору об’єднали для отримання змішаного зразка, який потім розділили на п’ять зразків глобального внутрішнього стандарту (GIS) (48). Усі індивідуальні зразки та комбіновані стандарти висушують за допомогою високошвидкісного вакууму (Labconco).
CSF копіює зразок. Дейон та його колеги раніше описували виснаження імунітету та перетравлення зразків копії 3 СМР (45, 46). Інші повторні зразки не були індивідуально ослабленими. Переваріть ці невилучені зразки в трипсині, як описано раніше (17). Для кожного повторного аналізу 120 мкл аліквоти елюйованого пептиду з кожного зразка об’єднували разом і ділили на аліквоти рівного об’єму для використання як глобального внутрішнього стандарту, міченого TMT (48). Усі індивідуальні зразки та комбіновані стандарти висушують за допомогою високошвидкісного вакууму (Labconco). Для посилення сигналу білка CSF з низьким вмістом, об’єднавши 125 мкл з кожного зразка, для кожного повторного аналізу готували «покращений» зразок [тобто біологічний зразок, який імітує дослідницький зразок, але доступна кількість набагато більший (37, 69)], злитий у змішаний зразок СМР (17). Потім змішаний зразок був імунологічно видалений за допомогою 12 мл High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), розщеплений, як описано вище, і включений у подальше багаторазове маркування TMT.
Час публікації: 27 серпня 2021 р