Дякуємо, що відвідали Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Термофіли - це мікроорганізми, які розвиваються при високих температурах. Вивчення їх може надати цінну інформацію про те, як життя пристосовується до екстремальних умов. Однак за допомогою звичайних оптичних мікроскопів важко досягти умов високої температури. Було запропоновано кілька саморобних рішень на основі локального резистивного електричного нагріву, але простого комерційного рішення немає. У цій статті ми представляємо концепцію мікромасштабного лазерного нагрівання в полі зору мікроскопа, щоб забезпечити високі температури для термофільних досліджень, зберігаючи при цьому м’яке середовище користувача. Мікромасштабне нагрівання при помірній інтенсивності лазера можна досягти за допомогою підкладки, покритої золотими наночастинками, як біосумісного та ефективного поглинача світла. Обговорюються можливі ефекти мікромасштабної конвекції рідини, утримання клітин і відцентрового термофоретичного руху. Метод було продемонстровано на двох видах: (i) Geobacillus stearothermophilus, активна термофільна бактерія, яка розмножується приблизно при 65°C, яка, як ми спостерігали, проростає, росте та плаває під мікромасштабним нагріванням; (ii) Thiobacillus sp., оптимально гіпертермофільна архея. при 80°C. Ця робота прокладає шлях до простого та безпечного спостереження за термофільними мікроорганізмами за допомогою сучасних та доступних інструментів мікроскопії.
Протягом мільярдів років життя на Землі розвивалося, щоб адаптуватися до широкого діапазону умов навколишнього середовища, які іноді вважаються екстремальними з людської точки зору. Зокрема, деякі термофільні мікроорганізми (бактерії, археї, гриби), які називаються термофілами, розвиваються в діапазоні температур від 45°C до 122°C1, 2, 3, 4. Термофіли живуть у різних екосистемах, таких як глибоководні гідротермальні джерела, гарячі джерела або вулканічні території. Їхні дослідження викликали великий інтерес протягом останніх кількох десятиліть принаймні з двох причин. По-перше, ми можемо дізнатися з них, наприклад, як термофіли 5, 6, ферменти 7, 8 і мембрани 9 стабільні при таких високих температурах, або як термофіли можуть витримувати екстремальні рівні радіації10. По-друге, вони є основою для багатьох важливих біотехнологічних застосувань1,11,12, таких як виробництво палива13,14,15,16, хімічний синтез (дигідро, спирти, метан, амінокислоти тощо)17, біовидобуток18 і термостабільні біокаталізатори7,11, 13. Зокрема, добре відома полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)19 включає фермент (Taq полімеразу), виділений із термофільної бактерії Thermus aquaticus, однієї з перших відкритих термофілів.
Проте вивчення термофілів не є легким завданням і не може бути імпровізовано в будь-якій біологічній лабораторії. Зокрема, живих термофілів неможливо спостерігати in vitro за допомогою будь-якого стандартного світлового мікроскопа, навіть за допомогою комерційно доступних нагрівальних камер, які зазвичай розраховані на низькі температури до 40°C. З 1990-х років лише кілька дослідницьких груп присвятили себе впровадженню систем високотемпературної мікроскопії (HTM). У 1994 році Glukh et al. Камера нагріву/охолодження була задумана на основі використання камери Пельтьє, яка контролює температуру прямокутних капілярів, закритих для підтримки анаеробності 20 . Пристрій можна нагрівати до 100 °C зі швидкістю 2 °C/с, що дозволяє авторам вивчати рухливість гіпертермофільної бактерії Thermotoga maritima21. У 1999 році Horn та ін. Було розроблено дуже схожий пристрій, який все ще базується на використанні нагрітих капілярів, придатних для комерційної мікроскопії для вивчення поділу/з’єднання клітин. Після тривалого періоду відносної бездіяльності пошук ефективних HTM відновився в 2012 році, зокрема у зв’язку з серією робіт групи Вірта, в яких використовувався пристрій, винайдений Хорном та ін. П'ятнадцять років тому рухливість великої кількості архей, у тому числі гіпертермофілів, вивчалася при температурах до 100 °C за допомогою нагрітих капілярів 23, 24. Вони також модифікували оригінальний мікроскоп, щоб досягти швидшого нагрівання (кілька хвилин замість 35 хвилин, щоб досягти встановленої температури) і досягти лінійного градієнта температури понад 2 см у середовищі. Цей пристрій формування температурного градієнта (TGFD) використовувався для вивчення мобільності багатьох термофілів у межах температурних градієнтів на біологічно значущих відстанях 24, 25 .
Нагрівання закритих капілярів - не єдиний спосіб спостерігати за живими термофілами. У 2012 році Кувабара та ін. Використовувалися саморобні одноразові камери Pyrex, запечатані термостійким клеєм (Super X2; Cemedine, Японія). Зразки поміщали на комерційно доступну прозору нагрівальну пластину (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Японія), здатну нагріватися до 110°C, але спочатку не призначену для біозображення. Автори спостерігали ефективний поділ анаеробних термофільних бактерій (Thermosipho globiformans, час подвоєння 24 хв) при 65°C. У 2020 році Pulshen et al. Ефективне нагрівання комерційного металевого посуду (AttofluorTM, Thermofisher) було продемонстровано за допомогою двох саморобних нагрівальних елементів: кришки та столика (конфігурація на основі ПЛР-машини). Це об’єднання забезпечує рівномірну температуру рідини та запобігає випаровуванню та конденсації на дні кришки. Використання ущільнювального кільця дозволяє уникнути газообміну з навколишнім середовищем. Цей HTM, який називається Sulfoscope, використовувався для зображення Sulfolobus acidocaldarius при 75°C27.
Визнаним обмеженням усіх цих систем було обмеження на використання повітряних об’єктивів, будь-яке занурення в масло було непридатним для такої високої температури та для отримання зображень через прозорі зразки товщиною >1 мм. Визнаним обмеженням усіх цих систем було обмеження на використання повітряних об’єктивів, будь-яке занурення в масло було непридатним для такої високої температури та для отримання зображень через прозорі зразки товщиною >1 мм. Загальновідомим недоліком усіх цих систем було обмеження на використання повітряних об’єктивів, оскільки будь-яке занурення в масло не підходило для такої високої температури та для візуалізації через прозорі зразки товщиною > 1 мм. Визнаним недоліком усіх цих систем було обмеження використання повітряних об’єктивів, оскільки будь-яке занурення в масло не було придатним для такої високої температури та для візуалізації через прозорі зразки товщиною > 1 мм.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1毫米厚的透明样品成像。 Визнаним обмеженням усіх цих систем є обмеження використання дзеркала з повітряним захопленням, оскільки будь-яке занурення в масло непридатне для зображення прозорих зразків товщиною >1 мм за таких високих температур. Загальновідомим недоліком усіх цих систем є обмежене використання повітряних об’єктивів, будь-яке занурення в масло, неприйнятне для таких високих температур, і візуалізація через прозорі зразки товщиною >1 мм. Визнаним недоліком усіх цих систем є обмежене використання повітряних лінз, будь-яке масляне занурення непридатне для таких високих температур і візуалізації через прозорі зразки товщиною >1 мм.Нещодавно це обмеження було знято Чарльзом-Орзагом та ін. 28, який розробив пристрій, який більше не забезпечує тепло навколо системи, що цікавить, а скоріше всередині самого покривного скла, покритого тонким прозорим шаром резистора з ITO (оксиду індію та олова). Кришку можна нагріти до 75 °C, пропускаючи електричний струм через прозорий шар. Однак автор також повинен нагріти лінзу до об'єктива, але не вище 65 °C, щоб не пошкодити її.
Ці роботи показують, що розвиток ефективної високотемпературної оптичної мікроскопії не отримав широкого поширення, часто вимагає саморобного обладнання та часто досягається ціною просторової роздільної здатності, що є серйозним недоліком, враховуючи, що термофільні мікроорганізми не перевищують кілька розмірів. мікрометрів. Зменшення об’єму нагріву є ключем до вирішення трьох притаманних проблем HTM: погана просторова роздільна здатність, висока теплова інерція під час нагрівання системи та шкідливе нагрівання оточуючих елементів (іммерсійна олія, об’єктив… або руки користувача) за екстремальних температур. ).
У цій статті ми представляємо HTM для спостереження термофілів, який не базується на резистивному нагріванні. Замість цього ми досягли локалізованого нагрівання в обмеженій області поля зору мікроскопа за допомогою лазерного опромінення світлопоглинаючої підкладки. Розподіл температури візуалізували за допомогою кількісної фазової мікроскопії (QPM). Ефективність цього методу продемонстрована Geobacillus stearothermophilus, рухливою термофільною бактерією, яка розмножується при температурі близько 65 °C і має короткий час подвоєння (приблизно 20 хвилин), і Sulfolobus shibatae, гіпертермофілом, який оптимально росте при 80 °C (архей) щоб проілюструвати. Нормальну швидкість реплікації та плавання спостерігали як функцію температури. Цей лазер HTM (LA-HTM) не обмежений товщиною покривного скла або природою об’єктива (повітряна або масляна імерсія). Це дозволяє використовувати будь-який об’єктив з високою роздільною здатністю на ринку. Він також не страждає від повільного нагріву через термічну інерцію (досягає миттєвого нагріву в масштабі мілісекунд) і використовує лише комерційно доступні компоненти. Єдині нові проблеми безпеки пов’язані з наявністю потужних лазерних променів (зазвичай до 100 мВт) усередині пристрою та, можливо, через очі, для чого потрібні захисні окуляри.
Принцип LA-HTM полягає у використанні лазера для локального нагрівання зразка в полі зору мікроскопа (рис. 1а). Для цього зразок повинен бути світлопоглинаючим. Щоб використовувати розумну потужність лазера (менше 100 мВт), ми не покладалися на поглинання світла рідким середовищем, а штучно збільшили поглинання зразка шляхом покриття підкладки наночастинками золота (рис. 1c). Нагрівання наночастинок золота світлом має фундаментальне значення для термічної плазмоніки з очікуваним застосуванням у біомедицині, нанохімії або зборі сонячного світла29,30,31. Протягом останніх кількох років ми використовували цей LA-HTM у кількох дослідженнях, пов’язаних із застосуванням теплової плазми у фізиці, хімії та біології. Основна складність цього методу полягає у відображенні кінцевого температурного профілю, оскільки підвищена температура обмежена областю мікромасштабу всередині зразка. Ми показали, що картографування температури можна досягти за допомогою інтерферометра поперечного зсуву з чотирма довжинами хвилі, простого, високого роздільної здатності та дуже чутливого методу кількісної фазової мікроскопії, заснованого на використанні двовимірних дифракційних ґраток (також відомих як перехресні ґратки). 33,34,35,36. Надійність цієї техніки термічної мікроскопії, заснованої на мікроскопії хвильового фронту схрещеної гратки (CGM), була продемонстрована в дюжині статей, опублікованих за останнє десятиліття37,38,39,40,41,42,43.
Схема установки паралельного лазерного нагрівального, формувального і температурного мікроскопа. b Геометрія зразка, що складається з камери AttofluorTM, що містить покривне скельце, покрите наночастинками золота. c Уважно подивіться на зразок (не в масштабі). d представляє однорідний профіль лазерного променя, а (e) змодельований наступний розподіл температури на площині зразка наночастинок золота. f — кільцевий профіль лазерного променя, придатний для створення рівномірної температури, як показано в моделюванні результуючого розподілу температури, показаного на (g). Масштабна шкала: 30 мкм.
Зокрема, нещодавно ми досягли нагрівання клітин ссавців за допомогою LA-HTM і CGM і відстежували відповіді клітинного теплового шоку в діапазоні 37-42 °C, демонструючи застосовність цієї методики для зображення окремої живої клітини. Однак застосування LA-HTM для дослідження мікроорганізмів при високих температурах не є однозначним, оскільки вимагає більшої обережності порівняно з клітинами ссавців: по-перше, нагрівання дна середовища на десятки градусів (а не на кілька градусів) призводить до до сильного вертикального градієнта температури. може створювати конвекцію рідини 44, яка, якщо вона не міцно прикріплена до субстрату, може спричинити небажаний рух і змішування бактерій. Цю конвекцію можна усунути, зменшивши товщину шару рідини. З цією метою в усіх наведених нижче експериментах бактеріальні суспензії поміщали між двома покривними скельцями товщиною приблизно 15 мкм, розміщеними всередині металевої чашки (AttofluorTM, Thermofisher, рис. 1b,c). В принципі, конвекції можна уникнути, якщо товщина рідини менше розміру променя нагрівального лазера. По-друге, робота в такій обмеженій геометрії може задушити аеробні організми (див. рис. S2). Цієї проблеми можна уникнути, використовуючи субстрат, який пропускає кисень (або будь-який інший життєво важливий газ), залишаючи захоплені бульбашки повітря всередині покривного скельця або просвердлюючи отвори у верхньому покривному склі (див. рис. S1) 45 . У цьому дослідженні ми обрали останнє рішення (рис. 1b і S1). Нарешті, лазерне нагрівання не забезпечує рівномірного розподілу температури. Навіть при однаковій інтенсивності лазерного променя (рис. 1d) розподіл температури не є рівномірним, а скоріше нагадує розподіл Гауса через термодифузію (рис. 1e). Коли метою є встановлення точних температур у полі зору для вивчення біологічних систем, нерівні профілі не є ідеальними і також можуть призвести до термофоретичного руху бактерій, якщо вони не прилипають до субстрату (див. рис. S3, S4)39. З цією метою ми використовували просторовий модулятор світла (SLM), щоб сформувати інфрачервоний лазерний промінь відповідно до форми кільця (рис. 1f) у площині зразка, щоб досягти ідеально рівномірного розподілу температури в заданій геометричній області, незважаючи на теплову дифузію (рис. 1d) 39, 42, 46. Помістіть верхнє покривне скельце на металеву чашку (рис. 1b), щоб уникнути випаровування середовища, і спостерігайте протягом принаймні кількох днів. Оскільки це верхнє покривне скельце не запечатане, додаткове середовище можна легко додати в будь-який час, якщо це необхідно.
Щоб проілюструвати, як працює LA-HTM, і продемонструвати його застосування в термофільних дослідженнях, ми вивчили аеробні бактерії Geobacillus stearothermophilus, які мають оптимальну температуру росту близько 60-65°C. Бактерія також має джгутики та здатність плавати, що є ще одним показником нормальної клітинної активності.
Зразки (рис. 1b) попередньо інкубували при 60°C протягом однієї години, а потім поміщали в тримач зразків LA-HTM. Ця попередня інкубація необов’язкова, але все ж корисна з двох причин: по-перше, коли лазер увімкнено, клітини негайно ростуть і діляться (див. фільм M1 у Додаткових матеріалах). Без попередньої інкубації ріст бактерій зазвичай сповільнюється приблизно на 40 хвилин кожного разу, коли на зразку нагрівається нова область перегляду. По-друге, 1-годинна попередня інкубація сприяла адгезії бактерій до покривного скла, запобігаючи дрейфу клітин із поля зору через термофорез, коли лазер був увімкнений (див. плівку M2 у Додаткових матеріалах). Термофорез — це рух частинок або молекул вздовж температурного градієнта, зазвичай від гарячого до холодного, і бактерії не є винятком43,47. Цей небажаний ефект усувається на певній ділянці за допомогою SLM для формування лазерного променя та досягнення рівномірного розподілу температури.
На рис. На рисунку 2 показано розподіл температури, виміряний CGM, отриманий шляхом опромінення скляної підкладки, покритої наночастинками золота, кільцевим лазерним променем (рис. 1f). Спостерігався плоский розподіл температури по всій площі, охопленій лазерним променем. У цій зоні було встановлено 65°C, оптимальну температуру росту. За межами цієї області температурна крива природним чином опускається до \(1/r\) (де \(r\) — радіальна координата).
Температурна карта вимірювань CGM, отримана за допомогою кільцевого лазерного променя для опромінення шару наночастинок золота для отримання плоского температурного профілю на круглій області. б Ізотерма карти температури (а). Контур лазерного променя представлений сірим пунктирним колом. Експеримент повторили двічі (див. Додаткові матеріали, рис. S4).
Життєздатність бактеріальних клітин спостерігали протягом кількох годин за допомогою LA-HTM. На рис. 3 показує часовий інтервал для чотирьох зображень, зроблених із фільму тривалістю 3 години 20 хвилин (фільм M3, додаткова інформація). Було помічено, що бактерії активно розмножуються в межах кругової області, визначеної лазером, де температура була оптимальною, наближаючись до 65 °C. Навпаки, ріст клітин значно знижувався, коли температура падала нижче 50 °C протягом 10 с.
Зображення оптичної глибини росту бактерій G. stearothermophilus після лазерного нагрівання в різний час, (а) t = 0 хв, (б) 1 год 10 хв, (в) 2 год 20 хв, (г) 3 год 20 хв, поза 200 Витягнуто з однохвилинного фільму (плівка M3, надана в Додатковій інформації), накладеного на відповідну температурну карту. Лазер вмикається в момент \(t=0\). До зображення інтенсивності додано ізотерми.
Для подальшої кількісної оцінки росту клітин і його залежності від температури ми виміряли збільшення біомаси різних колоній спочатку ізольованих бактерій у полі зору Movie M3 (рис. 4). Батьківські бактерії, відібрані на початку формування міні-колонієутворюючої одиниці (mCFU), показані на малюнку S6. Вимірювання сухої маси проводили за допомогою камери CGM 48, яка використовувалася для картографування розподілу температури. Здатність CGM вимірювати суху вагу та температуру є перевагою LA-HTM. Як і очікувалося, висока температура викликала прискорений ріст бактерій (рис. 4а). Як показано на напівлогарифмічному графіку на рис. 4b, зростання за всіх температур відбувається за експоненціальним зростанням, де дані використовують експоненціальну функцію \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), де \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – час генерації (або час подвоєння), \( g =1/ \tau\) – швидкість росту (кількість поділок за одиницю часу). На рис. 4c показує відповідну швидкість росту та час генерації як функцію температури. Швидко зростаючі мКУО характеризуються насиченістю росту через дві години, очікуваною поведінкою через високу щільність бактерій (подібно до стаціонарної фази в класичних рідких культурах). Загальна форма \(g\left(T\right)\) (рис. 4c) відповідає очікуваній двофазовій кривій для G. stearothermophilus з оптимальною швидкістю росту близько 60-65°C. Зіставте дані за кардинальною моделлю (рис. S5)49, де \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, що добре узгоджується з іншими значеннями, наведеними в літературі49. Хоча параметри, що залежать від температури, можна відтворити, максимальна швидкість зростання \({G}_{0}\) може змінюватися від одного експерименту до іншого (див. малюнки S7-S9 і фільм M4). На відміну від параметрів підгонки температури, які мають бути універсальними, максимальна швидкість росту залежить від властивостей середовища (наявність поживних речовин, концентрація кисню) у межах спостережуваної геометрії мікромасштабу.
ріст мікробів при різних температурах. mCFU: мініатюрні колонієутворюючі одиниці. Дані, отримані з відео однієї бактерії, що росте в градієнті температури (відео M3). b Те саме, що (a), напівлогарифмічна шкала. c Швидкість росту\(\tau\) і час генерації\(g\), розраховані за допомогою лінійної регресії (b). Горизонтальні смуги помилок: температурний діапазон, у якому mCFUs розширювалися в полі зору під час росту. Вертикальні стовпчики похибок: стандартна похибка лінійної регресії.
На додаток до нормального росту деякі бактерії іноді з’являлися в полі зору під час лазерного нагрівання, що є очікуваною поведінкою для бактерій із джгутиками. Фільм M5 у додатковій інформації показує такі види плавання. У цьому експерименті однорідне лазерне випромінювання використовувалося для створення градієнта температури, як показано на малюнках 1d, e та S3. На рисунку 5 показано дві послідовності зображень, вибраних із фільму M5, які показують, що одна бактерія демонструє спрямований рух, тоді як усі інші бактерії залишаються нерухомими.
Два часові рамки (a) і (b) показують плавання двох різних бактерій, позначених пунктирними колами. Зображення взято з фільму M5 (надається як додатковий матеріал).
У випадку G. stearothermophilus активний рух бактерій (рис. 5) починався через кілька секунд після ввімкнення лазерного променя. Це спостереження підкреслює часову реакцію цього термофільного мікроорганізму на підвищення температури, як це вже спостерігали Mora et al. 24 . Тема бактеріальної рухливості та навіть термотаксису може бути додатково досліджена за допомогою LA-HTM.
Мікробне плавання не слід плутати з іншими типами фізичного руху, а саме (i) броунівським рухом, який здається хаотичним рухом без певного напрямку, (ii) конвекцією 50 і термофорезом 43, що полягає в регулярному дрейфі руху вздовж температури градієнт.
G. stearothermophilus відомий своєю здатністю виробляти високостійкі спори (утворення спор) під впливом несприятливих умов навколишнього середовища як захист. Коли умови середовища знову стають сприятливими, спори проростають, утворюючи живі клітини та відновлюючи ріст. Хоча цей процес споруляції/проростання добре відомий, його ніколи не спостерігали в реальному часі. Використовуючи LA-HTM, ми повідомляємо тут про перше спостереження подій проростання у G. stearothermophilus.
На рис. 6а показані сповільнені зображення оптичної глибини (OT), отримані з використанням набору CGM із 13 спор. За весь час збору (15 год 6 хв, \(t=0\) – початок лазерного нагріву) проросло 4 з 13 спор, в послідовні моменти часу \(t=2\) год, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' і \(11\) h \(30\)'. Хоча лише одна з цих подій показана на малюнку 6, у фільмі M6 у додатковому матеріалі можна спостерігати 4 події проростання. Цікаво, що проростання виявляється випадковим: не всі спори проростають і не проростають одночасно, незважаючи на однакові зміни умов середовища.
покадрова зйомка, що складається з 8 OT зображень (масляна імерсія, 60x, об’єктив 1,25 NA) і (b) еволюція біомаси агрегатів G. stearothermophilus. c (b) Намальовано в напівлогарифмічному масштабі, щоб підкреслити лінійність швидкості росту (пунктирна лінія).
На рис. 6b,c показує біомасу популяцій клітин у полі зору як функцію часу протягом усього періоду збору даних. Швидкий розпад сухої маси, який спостерігається при \(t=5\)год на рис. 6б, в, за рахунок виходу деяких клітин із поля зору. Швидкість зростання цих чотирьох подій становить \(0,77\pm 0,1\) год-1. Це значення вище, ніж швидкість росту, пов’язана з рисунком 3. 3 і 4, де клітини ростуть нормально. Причина збільшення швидкості росту G. stearothermophilus із спор незрозуміла, але ці вимірювання підкреслюють інтерес LA-HTM і працюють на рівні однієї клітини (або на рівні однієї mCFU), щоб дізнатися більше про динаміку життя клітини. .
Щоб додатково продемонструвати універсальність LA-HTM і його ефективність при високих температурах, ми дослідили ріст Sulfolobus shibatae, гіпертермофільних ацидофільних архей з оптимальною температурою росту 80°C51. Порівняно з G. stearothermophilus, ці археї також мають зовсім іншу морфологію, нагадуючи кулі розміром 1 мікрон (коки), а не подовжені палички (бацили).
Малюнок 7а складається з послідовних зображень оптичної глибини S. shibatae mCFU, отриманих за допомогою CGM (див. художній фільм M7 у Додаткових матеріалах). Цей mCFU зростає приблизно при 73°C, нижче оптимальної температури 80°C, але в межах температурного діапазону для активного росту. Ми спостерігали численні події поділу, які зробили mCFU схожими на мікрогронні археї через кілька годин. З цих зображень OT біомаса mCFU була виміряна протягом тривалого часу та представлена на малюнку 7b. Цікаво, що mCFU S. shibatae показали лінійне зростання, а не експоненціальне зростання, яке спостерігається з mCFU G. stearothermophilus. Існує давня дискусія 52 про природу швидкості росту клітин: у той час як деякі дослідження повідомляють про швидкість росту мікробів, пропорційну їхньому розміру (експоненціальний ріст), інші показують постійну швидкість (лінійний або білінійний ріст). Як пояснили Цур та ін.53, розрізнення між експоненціальним і (бі)лінійним зростанням вимагає точності <6% у вимірюваннях біомаси, що є недосяжним для більшості методів QPM, навіть із залученням інтерферометрії. Як пояснили Цур та ін.53, розрізнення між експоненціальним і (бі)лінійним зростанням вимагає точності <6% у вимірюваннях біомаси, що є недосяжним для більшості методів QPM, навіть із залученням інтерферометрії. Як пояснили Кур і др.53, відмінність експоненціального та (бі)лінійного зростання вимагає точності <6% у вимірах біомаси, що недостижимо для більшості методів QPM, навіть з використанням інтерферометрії. Як пояснили Zur та ін.53, розрізнення між експоненціальним і (бі)лінійним зростанням вимагає <6% точності вимірювань біомаси, що є недосяжним для більшості методів QPM, навіть з використанням інтерферометрії.Як пояснили Zur et al. 53, розрізнення між експоненціальним і (бі)лінійним зростанням вимагає менше 6% точності вимірювань біомаси, що є недосяжним для більшості методів QPM, навіть якщо використовується інтерферометрія. CGM досягає цієї точності з точністю до суб-пг у вимірюваннях біомаси36,48.
покадрова зйомка, що складається з 6 OT-зображень (масляна імерсія, 60x, NA об’єктив 1,25) та (b) еволюція мікро-КУО біомаси, виміряна за допомогою CGM. Дивіться фільм M7 для отримання додаткової інформації.
Ідеально лінійний ріст S. shibatae був несподіваним і про нього ще не повідомлялося. Однак очікується експоненціальне зростання, принаймні тому, що з часом мають відбутися численні поділи 2, 4, 8, 16 … клітин. Ми припустили, що лінійний ріст може бути спричинений інгібуванням клітин через щільне упакування клітин, подібно до того, як ріст клітин сповільнюється і зрештою досягає стану спокою, коли щільність клітин занадто висока.
Ми закінчуємо обговоренням наступних п’яти цікавих моментів по черзі: зменшення об’єму нагріву, зменшення теплової інерції, інтерес до наночастинок золота, інтерес до кількісної фазової мікроскопії та можливий діапазон температур, у якому можна використовувати LA-HTM.
У порівнянні з резистивним нагріванням лазерне нагрівання, що використовується для розробки HTM, пропонує кілька переваг, які ми проілюструємо в цьому дослідженні. Зокрема, у рідких середовищах у полі зору мікроскопа об’єм нагріву зберігається в межах кількох (10 мкм) 3 об’ємів. Таким чином активні тільки спостережувані мікроби, тоді як інші бактерії знаходяться в стані спокою і можуть бути використані для подальшого дослідження зразка – немає необхідності міняти зразок кожного разу, коли потрібно перевірити нову температуру. Крім того, мікромасштабне нагрівання дозволяє безпосередньо досліджувати широкий діапазон температур: малюнок 4c було отримано з 3-годинного фільму (фільм M3), який зазвичай вимагає підготовки та дослідження кількох зразків – по одному для кожного досліджуваного зразка. y — температура, яка представляє кількість днів у експерименті. Зменшення нагрітого об’єму також підтримує кімнатну температуру всіх оточуючих оптичних компонентів мікроскопа, особливо лінзи об’єктива, що досі було основною проблемою, з якою стикалася спільнота. LA-HTM можна використовувати з будь-якими об’єктивами, включно з масляними імерсійними, і зберігатиме кімнатну температуру навіть за екстремальних температур у полі зору. Основним обмеженням методу лазерного нагрівання, про який ми повідомляємо в цьому дослідженні, є те, що клітини, які не прилипають або плавають, можуть бути далеко від поля зору, і їх важко досліджувати. Обхідним шляхом може бути використання лінз із малим збільшенням для досягнення більшого підвищення температури понад кілька сотень мікрон. Ця обережність супроводжується зниженням просторової роздільної здатності, але якщо метою є вивчення руху мікроорганізмів, висока просторова роздільна здатність не потрібна.
Шкала часу для нагрівання (та охолодження) системи \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) залежить від її розміру, за законом \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), де \ (L\ ) - характерний розмір джерела тепла (діаметр лазерного променя в нашому дослідженні \(L\ близько 100\) мкм), \(D\) - коефіцієнт температуропровідності середовища (середній у нашому корпус, скло та вода Швидкість дифузії\(D\приблизно 2\кратно {10}^{-7}\) м2/с, тому в цьому дослідженні часові відгуки порядку 50 мс, тобто квазімиттєві). Це миттєве встановлення підвищення температури не тільки скорочує тривалість експерименту, але також дозволяє точно визначити час \(t=0\) для будь-якого динамічного дослідження ефектів температури.
Запропонований нами метод застосовний до будь-якої світлопоглинаючої підкладки (наприклад, комерційні зразки з покриттям ITO). Однак наночастинки золота здатні забезпечувати високе поглинання в інфрачервоному діапазоні та низьке поглинання у видимому діапазоні, останні характеристики яких представляють інтерес для ефективного оптичного спостереження у видимому діапазоні, особливо при використанні флуоресценції. Крім того, золото є біосумісним, хімічно інертним, оптичну щільність можна регулювати від 530 нм до ближнього інфрачервоного діапазону, а підготовка зразків є простою та економічною29.
Мікроскопія хвильового фронту з поперечною решіткою (CGM) дозволяє не лише картувати температуру на мікромасштабі, але й здійснювати моніторинг біомаси, що робить її особливо корисною (якщо не необхідною) у поєднанні з LA-HTM. За останнє десятиліття були розроблені інші методи температурної мікроскопії, особливо в області біовізуалізації, і більшість з них вимагає використання чутливих до температури флуоресцентних зондів54,55. Однак ці методи піддавалися критиці, а в деяких звітах вимірювали нереалістичні зміни температури в клітинах, можливо, через те, що флуоресценція залежить від багатьох факторів, крім температури. Крім того, більшість флуоресцентних зондів нестабільні при високих температурах. Таким чином, QPM і, зокрема, CGM є ідеальною технікою температурної мікроскопії для вивчення життя при високих температурах за допомогою оптичної мікроскопії.
Дослідження S. shibatae, які оптимально живуть при 80°C, показують, що LA-HTM можна застосовувати для вивчення гіпертермофілів, а не лише простих термофілів. В принципі, немає обмежень для діапазону температур, які можна досягти за допомогою LA-HTM, і навіть температур вище 100°C можна досягти при атмосферному тиску без кипіння, як продемонструвала наша група з 38 осіб у застосуваннях гідротермальної хімії при атмосферному тиск А. Для нагрівання наночастинок золота 40 таким же чином використовується лазер. Таким чином, LA-HTM має потенціал для спостереження за безпрецедентними гіпертермофілами за допомогою стандартної оптичної мікроскопії високої роздільної здатності в стандартних умовах (тобто під впливом навколишнього середовища).
Усі експерименти проводили з використанням саморобного мікроскопа, включаючи освітлення Келера (зі світлодіодом, M625L3, Thorlabs, 700 мВт), тримач зразка з ручним рухом xy, об’єктиви (Olympus, 60x, 0,7 NA, повітря, LUCPlanFLN60X або 60x, 1,25 NA, масло , UPLFLN60XOI), камера CGM (перехресна решітка QLSI, крок 39 мкм, 0,87 мм від датчика камери Andor Zyla) для забезпечення інтенсивності та зображення хвильового фронту та камера sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, 16-бітний режим, від Hamamatsu) для запису дані показані на малюнку 5 (бактеріальне плавання). Дихроїчний світлорозділювач — це 749 нм BrightLine edge (Semrock, FF749-SDi01). Фільтр на передній панелі камери — це короткочастотний фільтр 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Титан-сапфіровий лазер (лазер Verdi G10, 532 нм, 10 Вт, резонатор лазера цунамі з накачуванням, Spectra-Physics на рис. 2-5, надалі замінений лазером Millenia, Spectraphysics 10 Вт, резонатор лазера Mira з накачуванням, Coherent, для рис. 2 -5). 6 і 7) встановлюються на довжину хвилі \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) нм, що відповідає спектру плазмонного резонансу наночастинок золота. Просторові модулятори світла (1920 × 1152 пікселя) були придбані у компанії Meadowlark Optics, розраховані за допомогою алгоритму Герхберга-Сакстона.
Мікроскопія хвильового фронту з перехресною решіткою (CGM) — це техніка оптичної мікроскопії, яка базується на поєднанні двовимірної дифракційної ґратки (також відомої як перехресна ґратка) на відстані одного міліметра від сенсора звичайної камери. Найпоширеніший приклад CGM, який ми використовували в цьому дослідженні, називається чотирихвильовим інтерферометром з поперечним зсувом (QLSI), де перехресна решітка складається з шахової таблиці інтенсивності/фази, представленої та запатентованої Primot et al. у 200034. Вертикальні та горизонтальні лінії решітки створюють сітоподібні тіні на датчику, викривлення яких можна чисельно обробити в реальному часі, щоб отримати спотворення оптичного хвильового фронту (або еквівалентний фазовий профіль) падаючого світла. При використанні на мікроскопі камера CGM може відображати різницю оптичного ходу зображеного об’єкта, також відому як оптична глибина (OT), з чутливістю порядку нанометрів36. Під час будь-якого вимірювання CGM, щоб усунути будь-які дефекти в оптичних компонентах або променях, необхідно взяти первинне еталонне OT зображення та відняти його від будь-яких наступних зображень.
Температурну мікроскопію проводили за допомогою камери CGM, як описано в посиланні. 32. Коротше кажучи, нагрівання рідини змінює її показник заломлення, створюючи ефект теплової лінзи, яка спотворює падаючий промінь. Це викривлення хвильового фронту вимірюється CGM і обробляється за допомогою алгоритму деконволюції для отримання тривимірного розподілу температури в рідкому середовищі. Якщо наночастинки золота рівномірно розподілені по всьому зразку, температурне картування можна зробити в зонах, вільних від бактерій, щоб отримати кращі зображення, що ми іноді робимо. Еталонне CGM-зображення було отримано без нагрівання (з вимкненим лазером), а потім знято в тому самому місці зображення з увімкненим лазером.
Вимірювання сухої маси досягається за допомогою тієї ж камери CGM, що використовується для зображення температури. Еталонні зображення CGM були отримані шляхом швидкого переміщення зразка по x і y під час експозиції як засіб усереднення будь-якої неоднорідності в OT через присутність бактерій. З OT-зображень бактерій їх біомасу було отримано за допомогою ансамблю зображень на ділянках, вибраних за допомогою саморобного алгоритму сегментації Matlab (див. підрозділ «Числовий код»), дотримуючись процедури, описаної в посиланні. 48. Коротше кажучи, ми використовуємо відношення \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), де \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) — зображення оптичної глибини, \(m\) — суха маса і \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) є константою. Ми вибрали \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) мкм3/пг, що є типовою константою для живих клітин.
Покривне скельце діаметром 25 мм і товщиною 150 мкм, покрите наночастинками золота, помістили в камеру AttofluorTM (Thermofisher) наночастинками золота вгору. Geobacillus stearothermophilus попередньо культивували протягом ночі в середовищі LB (200 об/хв, 60°C) перед кожним днем експериментів. Краплю 5 мкл суспензії G. stearothermophilus з оптичною густиною (ОП) від 0,3 до 0,5 наносили на покривне скло з наночастинками золота. Потім на краплю опускали кругле покривне скло діаметром 18 мм з отвором діаметром 5 мм у центрі і повторно наносили на центр отвору 5 мкл бактеріальної суспензії з такою ж оптичною щільністю. Лунки на покривних скельцях готували відповідно до процедури, описаної в посил. 45 (додаткову інформацію див. у Додатковій інформації). Потім додайте 1 мл середовища LB на покривне скло, щоб запобігти висиханню рідкого шару. Останнє покривне скельце поміщають на закриту кришку камери Attofluor™, щоб запобігти випаровуванню середовища під час інкубації. Для дослідів проростання ми використовували спори, які після звичайних дослідів іноді покривали верхнє покривне скельце. Подібним методом було отримано Sulfolobus shibatae. Три дні (200 об/хв, 75°C) проводили попереднє культивування Thiobacillus serrata в середовищі 182 (DSMZ).
Зразки наночастинок золота готували методом міцелярної блок-сополімерної літографії. Цей процес детально описано в гл. 60. Коротко кажучи, міцели, що інкапсулюють іони золота, були синтезовані шляхом змішування кополімеру з HAuCl4 у толуолі. Потім очищені покривні скла занурювали в розчин і обробляли УФ-опроміненням у присутності відновника для отримання золотих зародків. Нарешті, насіння золота вирощували шляхом контакту накривного скла з водним розчином KAuCl4 та етаноламіну протягом 16 хвилин, що призвело до квазіперіодичного та дуже рівномірного розташування несферичних наночастинок золота в ближньому інфрачервоному діапазоні.
Щоб перетворити інтерферограми на OT-зображення, ми використали саморобний алгоритм, детально описаний у посиланні. 33 і доступний як пакет Matlab у такому публічному сховищі: https://github.com/baffou/CGMprocess. Пакет може розраховувати інтенсивність і OT зображення на основі записаних інтерферограм (включаючи контрольні зображення) і відстаней групи камер.
Щоб обчислити фазову схему, застосовану до SLM для отримання заданого температурного профілю, ми використали попередньо розроблений саморобний алгоритм39,42, який доступний у такому публічному сховищі: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Введенням є бажане температурне поле, яке можна встановити цифровим способом або за допомогою монохромного BMP-зображення.
Щоб сегментувати клітини та виміряти їх суху вагу, ми використали наш алгоритм Matlab, опублікований у такому публічному сховищі: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. На кожному зображенні користувач повинен натиснути на цікаву бактерію або mCFU, налаштувати чутливість палички та підтвердити вибір.
Щоб отримати додаткові відомості про дизайн дослідження, перегляньте анотацію звіту про дослідження природи, посилання на яку наведено в цій статті.
Дані, що підтверджують результати цього дослідження, доступні у відповідних авторів за обґрунтованим запитом.
Вихідний код, використаний у цьому дослідженні, детально описано в розділі «Методи», а версії для налагодження можна завантажити з https://github.com/baffou/ у таких репозиторіях: SLM_temperatureShaping, CGMprocess і CGM_magicWandSegmentation.
Мехта, Р., Сінгхал, П., Сінгх, Х., Дамл, Д. і Шарма, А. К. Розгляд термофілів та їх широкого спектру застосування. Мехта, Р., Сінгхал, П., Сінгх, Х., Дамл, Д. і Шарма, А. К. Розгляд термофілів та їх широкого спектру застосування.Мехта, Р., Сінгхал, П., Сінгх, Х., Дамл, Д. і Шарма, А. К. Огляд термофілів і їх широке застосування. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Мехта Р., Сінгхал П., Сінгх Х., Дамл Д. і Шарма А.К.Мехта Р., Сінгхал П., Сінгх Х., Дамл Д. і Шарма А. К. Глибоке розуміння термофілів і широкий спектр застосувань.3 Біотехнологія 6, 81 (2016).
Час публікації: 26 вересня 2022 р